申请/专利权人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所;苏州市中心血站

申请日：2020-08-31

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN114107391B

主分类号：C12N15/866

分类号：C12N15/866;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.03.18#实质审查的生效;2022.03.01#公开

摘要：本发明公开了一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：1制备重组质粒；2制备重组Bacmid；3利用步骤2得到的重组Bacmid制备杆状病毒；4利用步骤3得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；5在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞。本发明通过利用染料木黄铜Genistein的酪氨酸激酶抑制剂的特点，将其与AAV介导的基因治疗联合起来使用，显著提高了AAV介导的基因在T淋巴细胞的表达效果。

主权项：1.一种利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1制备重组质粒；2利用步骤1得到的重组质粒制备重组Bacmid；3利用步骤2得到的重组Bacmid制备杆状病毒；4利用步骤3得到的杆状病毒制备重组rAAV病毒，然后进行纯化；5在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4得到的纯化后的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与T淋巴细胞共孵育，然后用重组rAAV病毒转染T淋巴细胞；所述步骤1包括：分别制备pFastbacdual-ITR-inCap6质粒、pFastbacdual-ITR-EGFP质粒和pFastbacdual-inrep质粒；所述步骤5具体包括：5-1配制染料木黄铜试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的DMSO中，保存备用；染料木黄铜试剂浓度为0.1um；5-2采用PBMC分离方法制备PBMC细胞；5-3T淋巴细胞培养：将步骤5-2制得的PBMC细胞用RPMI-1640细胞培养基重悬于T25培养瓶中，置于37℃5％CO2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到T淋巴细胞，备用；其中，RPMI-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ngml的OKT3、50ngml的CD28、300uml的IL-2；5-4将步骤5-1得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3得到的T淋巴细胞共孵育1h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4得到的重组rAAV病毒转染T淋巴细胞，培养72h。

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权利要求：

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