申请/专利权人：杭州迪安医学检验中心有限公司

申请日：2018-12-29

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN109554443B

主分类号：C12Q1/6858

分类号：C12Q1/6858;C12Q1/6883;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.12#授权;2020.12.08#实质审查的生效;2019.04.02#公开

摘要：本发明公开了一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的试剂盒和方法。该检测试剂盒基于Illumina高通量测序平台采用多重PCR捕获建库技术，检测DMD基因的79个外显子和3个内含子区域的外显子缺失重复、点突变的基因变异信息。该检测的多重PCR引物组为SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示的核酸序列，该试剂盒中含有SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示的核酸序列。本发明的检测试剂盒灵敏度高、准确性好、扩增子均一性好，能一次性对DMD基因变异信息包括外显子缺失重复、点突变的变异进行检测，可以用于产前诊断、阻止患儿出生，降低假肥大型肌营养不良症的发病率。

主权项：1.一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物组，其特征在于，由SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示的核苷酸序列及其5’端连接的Illumina测序平台建库所需的序列组成；正向引物5’端连接的序列如SEQIDNO：261所示；反向引物5’端连接的序列如SEQIDNO：262所示。

全文数据：一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的引物及其应用技术领域本发明属于基因测序领域，具体涉及一种基于Illumina高通量测序平台的多重PCR捕获技术快速检测假肥大型肌营养不良症致病基因变异的引物及其应用。背景技术假肥大型肌营养不良症pseudohypertrophymusculardystrophy包括杜兴型肌营养不良症Duchennemusculardystrophy，DMD和贝克型肌营养不良症Beackermusculardystrophy，BMD，二者均是由于抗肌萎缩蛋白dystrophin，dys基因突变所致的X连锁的隐性遗传病。DMDBMD患者dys缺乏主要导致了骨骼肌细胞膜缺陷，细胞内的肌酸激酶creatinekinase等外漏，肌细胞坏死、脂肪组织和纤维结缔组织增生。DMD是较严重的类型，其主要临床特征表现为进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大，同时累及心肌和呼吸肌，部分患者伴有智力障碍，发病率在活产男婴中高达13500，通常从3-5岁起病，12岁左右失去行走能力，20多岁死亡。BMD与DMD互为等位基因异质性疾病，发病年龄比DMD晚，进展速度慢，其发病率有报道为130000。目前假肥大型肌营养不良症的发病机制仍不明了，且国内外尚无有效治疗手段，通过对先证者的确诊、携带者的产前诊断和提供正确的产前基因诊断、婚育指导和遗传咨询是防止患儿出生及降低本病发病率的关键措施。DMD基因定位于Xp21.1～21.3，长度为2.4Mb，是人类最大的基因之一。cDNA全长1kb，含79个外显子，这样的基因易出现高频率的突变和异位断裂点，大约65-75％的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失重复所致，约30％是由于DMD基因点突变所致。目前DMD基因诊断的最有效方式是多重连接依赖式探针扩增技术multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA，MLPA是一种定量和半定量技术，可以检测DMD基因79个外显子拷贝数改变缺失、重复，但是MLPA技术不能检测点突变，而且有可能出现假阳性结果。其他DMD基因检测的方法还有：多重PCR、Southernblot、变性高效液相色谱DHPLC、抗肌萎缩蛋白的免疫组化、Sanger测序等方法，但这些方法均只能检出部分突变类型和已知突变，且检测通量低、检测周期长、准确率低。近年来随着高通量测序技术的发展，一次检测可涵盖40万到400万的序列，并且可以同时检测基因的缺失、重复和点突变多种突变类型，具有无可替代的高通量、检测变异类型全面和准确率高等优势，已广泛应用于各类生物学研究和医学检测。目前针对高通量测序技术的靶向捕获技术主要包括多重PCR捕获技术、探针捕获技术。相对于探针捕获技术，多重PCR捕获技术具有操作简单、灵活、开发成本低等显著优势。因此，基于高通量测序平台采用多重PCR捕获技术开发的检测DMD基因变异的试剂盒是一种快速、准确、全面检测的DMD基因各类型突变缺失、重复、点突变的产品，具有良好的市场应用价值。发明内容本发明要解决的技术问题是提供基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物。本发明还要解决的技术问题是提供DMD基因变异检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物，包括SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示的核苷酸序列。作为优选，SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列的5’端连接有Illumina测序平台建库所需的序列，正向引物5’端连接引物序列为：acacgacgctcttccgatct；反向引物5’端连接引物序列为：gacgtgtgctcttccgatct。一种检测DMD基因变异的试剂盒，该试剂盒中包括，SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列。检测DMD基因变异的的方法，该方法包括以下步骤：1将SEQIDNO.1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列分为两组，SEQIDNO：1～SEQIDNO：130所示核苷酸序列为A组引物，SEQIDNO：131～SEQIDNO：260所示核苷酸序列为B组引物，以样本DNA为模板，进行第一轮多重PCR反应，得到第一轮PCR产物；2使用P5通用引物、P7index引物，以与第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR反应，对第二轮扩增产物进行纯化，获得DMD基因变异测序文库；3文库质控、高通量测序，对下机数据进行生物信息学分析。文库质控：用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统BiOptic对文库进行片段分布检测，正常文库片段分布在200-400bp之间，100-500bp片段的平均大小为330-4000bp。生物信息分析：对下机的原始数据进行质量控制和数据筛选，以获得后续分析的fastq文件，利用序列比对软件将fastq文件中的序列比对到参考基因组上，再利用call变异软件进行变异检测。经10个样本的下机数据质量详见表3；经比对后，进行SNV、Indel的识别分析；CNV分析根据以往阴性非CNV样本获得的扩增子测序深度，与本次测序结果进行归一化处理后，按测序深度分析CNV缺失重复。其中，所述P5通用引物的核苷酸序列如SEQIDNO:263所示，所述P7index引物的核苷酸序列为SEQIDNO:264、六个随机碱基、SEQIDNO:265依次连接。。步骤1中，第一轮多重PCR的反应体系为：PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min15cycles；72℃5min，4℃hold；步骤2中，第二轮多重PCR的反应体系为：PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min8cycles；72℃5min，4℃hold；作为上述方法的优选，所述P5通用引物5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’P7index引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；序列中N表示ATCG任意碱基，NNNNNN用于识别不同样本构建的文库。有益效果：本发明针对DMD基因的79个外显子和3个内含子区域的外显子缺失重复、点突变在内的基因变异信息，提供了一种基于Illumina测序平台使用的多重PCR引物组，并基于引物组提供了一种DMD基因变异检测试剂盒及方法。本发明的检测试剂盒灵敏度高、准确性好、扩增子均一性好，能一次性对DMD基因变异信息包括外显子缺失重复、点突变进行检测。附图说明图1实施例2中样本2归一化之后测序深度图,其中2号样本测序深度图52-54号外显子缺失。图2实施例2中样本3归一化之后测序深度图，其中3号样本测序深度图3-25号外显子缺失。图3实施例2中样本5归一化之后测序深度图，5号样本检测结果5-7号外显子扩增。图4实施例2中样本8归一化之后测序深度图，8号样本检测结果18-44号外显子缺失。图5实施例2中样本10归一化之后测序深度图，10号样本检测结果阴性。具体实施方式一种检测DMD基因变异的多重PCR引物组，所述引物含有核苷酸序列如SEQID：1～SEQIDNO：260所示的引物序列。一种检测DMD基因变异的多重PCR引物，其特征在于，所述引物5’端连接有Illumina测序平台建库所需的序列。作为上述引物的优选，所述引物组分为A、B管，A管引物组含有的核苷酸序列为SEQID：1～SEQIDNO：130；B管引物组含有的核苷酸序列为SEQID：131～SEQIDNO：260。一种检测DMD基因变异的试剂盒，含有核苷酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO：260所示的核苷酸序列组。一种检测检测DMD基因变异的方法，包括：根据Illumina高通量测序平台建库需求，利用权利要求1～2任一项所述的引物组构建文库，经文库质控、高通量测序和生物信息分析，获得DMD基因的变异信息，所述变异信息包括外显子的缺失重复、点突变。作为上述方法的优选，所述方法进一步包括步骤：1使用多重PCR引物组，分两管捕获样本基因组DNA的靶区域，获得第一轮多重PCR扩增产物，对A、B管多重PCR进行合并后纯化；2使用P5通用引物、P7index引物与多重PCR纯化产物进行第二轮PCR扩增，对第二轮扩增产物进行纯化，获得文库；3文库质控、高通量测序，对下机数据进行生物信息学分析。作为上述方法的优选，A、B管多重PCR引物混合比例为1:1；作为上述方法的优选，任选地，步骤1中，20uL多重PCR的反应体系为：PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min15cycles；72℃5min，4℃hold；任选地，步骤2中，20uL多重PCR的反应体系为：PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min8cycles；72℃5min，4℃hold；作为上述方法的优选，所述P5通用引物5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’P7index引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；序列中N表示ATCG任意碱基，NNNNNN用于识别不同样本构建的文库。上述方法中，模板DNA可源于外周血、干血斑、组织、羊水等，但不限于此。下面结合具体实施例详细说明本发明，可以更好的理解本发明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不是为了限制本发明的范围和应用。实施例中所用的材料、试剂、一起等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，无特别说明的实验操作均按厂商说明书或本领域常规技术实施。实施例1：DMD基因多重PCR扩增引物组发明人根据UCSC数据库DMD基因的参考序列，针对DMD基因的79个外显子和3个内含子目标DNA序列设计多重PCR扩增引物，经过大量实验筛选、优化、验证，最终优选出130对260条引物引物序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示。实施例2：一种基于高通量测序技术的DMD基因变异检测试剂盒1、本试剂盒包括多重PCR酶Mix：该反应液中含有酶缓冲液、Mg2+、dNTPs、高保真DNA聚合酶。2、多重PCR引物组：该引物组由实施例1提供的SEQIDNO：1～SEQIDNO260所示引物进行分组，引物SEQIDNO：1～SEQIDNO：130分别稀释至10uM后等量混合为A管，引物SEQIDNO：131～SEQIDNO：260分别稀释至10uM后等量混合为B管。3、P5通用引物和P7index引物，使用浓度为10uM。实施例3：DMD基因变异检测方法本实施例给出一种基于Illumina测序平台使用多重PCR捕获技术检测DMD基因变异的方法，本实施例以杭州迪安医学检验中心有限公司NGS室提供的10例DMD患者携带者为例进行DMD基因突变检测，以上样本已经通过MLPA和sanger测序明确了致病突变信息。1、基因组DNA提取取外周血100uL-1mL，采用TIANampBloodDNAKit天根生化科技有限公司进行基因组DNA提取，对提取的基因组用Nanodrop2000进行纯度检测，并对QubitLifeTechnologies公司对基因组进行浓度测定，结果见表1。表1、10例样本基因组DNA纯度与浓度检测结果编号Nanodrop2000浓度nguLOD260280Qubit浓度nguL168.71.8263.4280.21.8869.2345.81.9041.04200.31.67170589.71.9073.86130.21.80112765.31.7457848.21.6237.89110.51.7392.61066.51.7857.62、多重PCR捕获文库构建使用实施例2中的DMD基因变异检测试剂盒进行多重PCR捕获文库的构建。1第一轮多重PCR扩增a按照下表配制20uL多重PCR反应体系：每个样本需同时进行A、B管多重PCR扩增，将以上PCR混合物充分混匀，短暂离心后，置于PCR仪上。b运行以下PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min15cycles；72℃5min，4℃hold；2第一轮多重PCR产物纯化利用Beckman纯化磁珠AMPureXPBeads或其他功能等效的纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。该纯化可有效的富集目标区域片段，除去多于的PCR引物及二聚体，降低非特异性产物的量。a将以上A、B两管扩增产物等体积混合共40μl，涡旋混匀，并瞬时离心，然后加入40μlAMPureXPBeads需事先从冰箱中取出并平衡至室温后使用，涡旋混匀，室温放置5分钟；b以上离心管瞬时离心，放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清避免吸起磁珠，弃上清；c然后加入200μl80％的乙醇，磁力架反复不少于两次在1.5ml离心管不同的两面来回吸附磁珠即在磁力架上旋转1.5ml离心管，使得磁珠在80％乙醇中来回游移，以充分洗涤磁珠，然后在磁力架上，静置1分钟；d小心吸去上清避免吸起磁珠，再次加入200μl80％的无水乙醇，重复步骤“c”；e用移液枪小心吸除上清，尽可能吸取干净避免吸起磁珠，然后将1.5ml离心管置于通风橱中，静置5分钟，使乙醇挥发完全；注：乙醇必须去除干净，否则残留的乙醇会严重影响得率和后续实验；f向离心管中加入10μl去离子水，瞬时涡旋，充分悬浮磁珠，室温放置5分钟；g将以上离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置5分钟，直至溶液澄清，小心吸取9μl上清，至新的PCR管中避免吸起磁珠，若不小心吸取磁珠，则重复步骤“6”，该纯化产物，应立即进行文库富集的扩增。3第二轮PCR扩增a按照下表配制20uL文库富集的扩增反应体系：其中P5通用引物SEQIDNO：263序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；P7index引物SEQIDNO：264、SEQIDNO：265序为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；序列中N表示ATCG任意碱基，NNNNNN用于识别不同样本构建的文库。以上引物也由英潍捷基上海贸易有限公司合成。将以上PCR混合物充分混匀，短暂离心后，置于PCR仪上。b运行以下PCR反应程序：PCR反应程序：98℃3min；98℃15s，60℃30s，72℃2min8cycles；72℃5min，4℃hold；3第二轮PCR产物的纯化将富集文库的扩增产物用Beckman纯化磁珠AMPureXPBeads进行纯化，扩增产物与磁珠添加比例为1:1，操作步骤与“第一轮多重PCR产物纯化”一致，获得文库。3、文库质控对文库进行Qubit定量，定量结果见表3。用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统BiOptic对文库进行片段分布检测，正常文库片段分布在200-400bp之间，100-500bp片段的平均大小为330-4000bp，本实施例中单个文库经Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测结果的平均大小见表2，以上10个文库质量合格。表2、上机前文库质控编号Qubit浓度nguL100-500bp平均大小bp是否合格14.18377.57合格23.30382.71合格33.22375.29合格47.64385.04合格58.92367.06合格65.54343.22合格73.1366.45合格82.64390.48合格93.00371.78合格103.04345.88合格4、高通量测序上机文库稀释和上机操作流程详见MiSeqsystemguide操作说明。5、生物信息分析上述10个样本经过测序后，对下机的原始数据进行质量控制和数据筛选，以获得后续分析的fastq文件，利用序列比对软件将fastq文件中的序列比对到参考基因组上，再利用call变异软件进行变异检测。经10个样本的下机数据质量详见表3；经比对后，进行SNV、Indel的识别分析；CNV分析根据以往阴性非CNV样本获得的扩增子测序深度，与本次测序结果进行归一化处理后，按测序深度分析CNV缺失重复。本实施例10例样本的检测结果与常规方法点突变检测的常规方法为：Sanger测序法；外显子缺失重复的常规方法为：多重连接依赖探针扩增法MLPA对比结果见表4，本发明检测结果与常规方法检测结果一致，本发明能同时对点突变、外显子缺失重复进行准确检测。表3、10例样本下机数据质量统计文库编号平均覆盖度Map率均一性1839.474.38％99.1％2468.965.0％98.7％3433.758.23％98.8％4791.471.26％99.0％51040.575.88％100％6861.873.68％99.4％7639.365.10％98.8％8482.858.83％100％9811.367.90％100％10846.268.99％98.8％表4、10例样本DMD变异检测结果与常规方法检测结果对比编号本发明检测结果常规方法检测结果判定结果1ex4.c94.1GAex4.c94.1GA一致2ex52～54缺失ex52～54缺失一致3ex3～25缺失ex3～25缺失一致4ex30.c4150GTex30.c4150GT一致5ex5～7扩增ex5～7扩增一致6阴性阴性一致7阴性阴性一致8ex18～44缺失ex18～44缺失一致9ex57.c8498delex57.c8498del一致10阴性阴性一致基于以上结果，本发明的一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异是试剂盒，包括本发明的DMD基因捕获多重PCR引物，可实现DMD基因变异信息的检测。以上内容是结合具体的实施方式对本发明作进一步的详细说明，本发明也不限于上述举例。本领域技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表杭州迪安医学检验中心有限公司一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的引物及其应用265SIPOSequenceListing1.0144DNA人工序列ArtificialSequence1acacgacgctcttccgatctcccatagaacactggaaaatattc44243DNA人工序列ArtificialSequence2gacgtgtgctcttccgatctgattgcaacaaaccaacagtgaa43345DNA人工序列ArtificialSequence3acacgacgctcttccgatctgtcttcactgcaattttagatactg45440DNA人工序列ArtificialSequence4gacgtgtgctcttccgatctgaatagtgtggtttgccagc40545DNA人工序列ArtificialSequence5acacgacgctcttccgatctagtctgtctctttttgtacatatac45644DNA人工序列ArtificialSequence6gacgtgtgctcttccgatctgtccatcttaatgtacatcacatc44744DNA人工序列ArtificialSequence7acacgacgctcttccgatcttcccaagcacatcatagtaactaa44843DNA人工序列ArtificialSequence8gacgtgtgctcttccgatcttttattgtgcagcatttggaagc43941DNA人工序列ArtificialSequence9acacgacgctcttccgatctaaagaaagctgtgtgccttgg411041DNA人工序列ArtificialSequence10gacgtgtgctcttccgatctccttctttgtcaggggtacat411145DNA人工序列ArtificialSequence11acacgacgctcttccgatctaatacaatcacctgaattttggagg451244DNA人工序列ArtificialSequence12gacgtgtgctcttccgatctcagaatcagaaactgaaagagttg441340DNA人工序列ArtificialSequence13acacgacgctcttccgatctcccatccgcagttagttact401445DNA人工序列ArtificialSequence14gacgtgtgctcttccgatctgcttcaagaagatctagaacaagaa451545DNA人工序列ArtificialSequence15acacgacgctcttccgatctaggcactgcaagacattaaagaatt451643DNA人工序列ArtificialSequence16gacgtgtgctcttccgatctagcgtacataggagactgagata431745DNA人工序列ArtificialSequence17acacgacgctcttccgatctctggtatgctatgttttatcaagag451843DNA人工序列ArtificialSequence18gacgtgtgctcttccgatctagtgcatggctttcagaaaaaga431944DNA人工序列ArtificialSequence19acacgacgctcttccgatctctaatctggttgcttcttttgtag442040DNA人工序列ArtificialSequence20gacgtgtgctcttccgatctggaatgcaacccaggcttat402145DNA人工序列ArtificialSequence21acacgacgctcttccgatcttgcgatagtgatttcttgtgaaagt452244DNA人工序列ArtificialSequence22gacgtgtgctcttccgatctaacacagacaactgtaatggaaac442345DNA人工序列ArtificialSequence23acacgacgctcttccgatctcttagaaggtgaacgtttcattact452440DNA人工序列ArtificialSequence24gacgtgtgctcttccgatctcctcagaacaactgaacagc402543DNA人工序列ArtificialSequence25acacgacgctcttccgatcttgtagggagaatggttccattta432641DNA人工序列ArtificialSequence26gacgtgtgctcttccgatcttccatactctatggcacagga412745DNA人工序列ArtificialSequence27acacgacgctcttccgatctctaccatacttgtcagaatgactta452845DNA人工序列ArtificialSequence28gacgtgtgctcttccgatctcaatttaggaaaacatggcaaagtg452945DNA人工序列ArtificialSequence29acacgacgctcttccgatctaagatgctgaaggtcaaatgcttat453044DNA人工序列ArtificialSequence30gacgtgtgctcttccgatcttttaggctttacaaagtt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权利要求：1.一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物，其特征在于，包括SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物，其特征在于，SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列的5’端连接有Illumina测序平台建库所需的序列。3.根据权利要求2所述基于高通量测序技术检测DMD基因变异的PCR引物，其特征在于，正向引物5’端连接序列如SEQIDNO：261所示；反向引物5’端连接序列如SEQIDNO：262所示。4.一种检测DMD基因变异的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括，SEQIDNO：1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列。5.检测DMD基因变异的的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1将SEQIDNO.1～SEQIDNO：260所示核苷酸序列分为两组，SEQIDNO：1～SEQIDNO：130所示核苷酸序列为A组引物，SEQIDNO：131～SEQIDNO：260所示核苷酸序列为B组引物，以样本DNA为模板，进行第一轮多重PCR，得到第一轮PCR产物；2使用P5通用引物、P7index引物，以与第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，对第二轮扩增产物进行纯化，获得DMD基因变异测序文库；3文库质控、高通量测序，对下机数据进行生物信息学分析。6.根据权利要求5所述检测DMD基因变异的的方法，其特征在于，所述P5通用引物的核苷酸序列如SEQIDNO:263所示，所述P7index引物的核苷酸序列为SEQIDNO:264、六个随机碱基、SEQIDNO:265依次连接。

百度查询： 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种基于高通量测序技术检测DMD基因变异的引物及其应用

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