申请/专利权人：岭南师范学院

申请日：2018-12-19

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN109652352B

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/70;C12N9/88;C12N11/10;C07K19/00;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.12#授权;2021.10.22#实质审查的生效;2019.04.19#公开

摘要：本发明公开了一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法。本发明提供了用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌Escherichiacoli（DH5α‑LNSF1），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60445。使用该基因工程菌可高效生产屎肠球菌GAD固定化酶，其方法为利用改性甲壳素亲和吸附CBM‑GAD融合酶粗酶液，即可获得屎肠球菌GAD固定化酶。该方法使用的改性甲壳素与CBM‑GAD融合酶的亲和性强、结合牢固，得到的GAD固定化酶活力和稳定性高，解决了GAD固定化难、半衰期短、成本高的问题；另外，该固定化方法快捷、效率高，成本大大降低，在高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的工业化生产方面具有广泛的应用前景。

主权项：1.一种使用大肠杆菌基因工程菌DH5α-LNSF1高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.在冰水浴条件下，于缓冲液中破碎大肠杆菌基因工程菌DH5α-LNSF1菌体，提取CBM-GAD融合酶粗酶液；所述大肠杆菌基因工程菌DH5α-LNSF1于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60445；所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；所述缓冲液的浓度为20mmolL，pH为8；S2.将CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素混合并搅拌，发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-GAD，滤除液体，分离到的固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶；所述CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶；所述CBM-GAD融合酶粗酶液体积与所述改性甲壳素的体积质量比为3～5:1，单位为mLg；所述改性甲壳素为经浓磷酸改性的甲壳素；所述经浓磷酸改性的甲壳素的制备方法为：在冰浴下，用浓磷酸溶解甲壳素至混合物变透明，再用冰水稀释使甲壳素充分沉淀，收集甲壳素沉淀，然后用蒸馏水或结合Na2CO3溶液将甲壳素沉淀洗涤至中性，即可得到浓磷酸改性的甲壳素。

全文数据：一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法技术领域本发明属于食品生物技术领域，更具体地，涉及一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法。背景技术谷氨酸脱羧酶glutamatedecarboxylase，GAD，EC4.1.1.15专一地催化L-谷氨酸L-glutamicacid,L-Gluα-羧基发生脱羧作用，在γ-氨基丁酸γ-aminobutyricacid,GABA生物合成和手性物质DL-谷氨酸DL-glutamicacid，DL-Glu的拆分方面具有重要应用BrazilianJournalofMicrobiology,2012,434:1230-1241；AminoAcids,2016,4811:2519-2531；化学与生物工程,2013,3011:55-56.。由于乳酸菌具有较好的安全性，便于在发酵食品中应用，乳酸菌GAD受到了极大关注，已发现短乳杆菌LactobacillusbrevisLWT-FoodSciTechnol,2016,67:22-26、副干酪乳杆菌LactobacillusparacaseiFoodMicrobiol2005,22:497-504、鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusBrazJMicrobiol2013；44:183-187、清酒乳杆菌LactobacillussakeiJMicrobiolBiotechnol2015；25:696-703、唾液链球菌嗜热亚种Streptococcussalivariusssp.thermophilus食品科学,2011,321:162-167、戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus湖北农业科学,2010,496:1450-1453、屎肠球菌Enterococcusfaecium食品科学,2018,394:90-98和植物乳杆菌LactobacillusplantarumMicrobiolBiotechnolLett,2015,43:300-305等微生物均具有GAD。然而，由于野生株GAD主要为了满足微生物抗酸机制的需要，表达量普遍不高，GAD活力低，同时游离酶难以回收，无法重复利用和连续化生产，因此应用成本高居高不下，难于满足GABA或DL-Glu工业化生产需要。由于固定化酶易于实现酶与反应液的分离、稳定酶的活性，便于酶的重复使用，降低生产成本，因此，固定化酶在工业生物催化领域备受关注。目前对GAD固定化主要集中在两个方面：①对具GAD的野生株细胞进行固定化；例如，黄俊用海藻酸钙胶珠对具有GAD活力的短乳杆菌细胞进行了固定化浙江大学博士学位论文，2006。②对重组GAD进行固定化：主要通过基因工程菌表达高活力GAD，再对GAD粗酶进行固定化；例如，朱菲用聚乙烯醇-海藻酸钠、Ni-NTA对重组短乳杆菌GAD的固定化进行了研究浙江大学硕士学位论文，2011；Lee等将大肠杆菌GAD与组氨酸标签融合表达，用镍螯合树脂固定重组酶，固定化酶重复使用10次仍可保留58％的初始活力InternationalJournalofMolecularSciences,2013,141:1728-1739。但是，已报道的固定化方法普遍存在固定化载体成本较高、操作繁琐、半衰期短、活力不高等问题，特别是很多固定化方法制备的固定化酶不是纯酶如固定化细胞，无法克服下游代谢酶或杂蛋白的影响。因此，仍亟需探寻便捷、稳定性高、成本低、酶纯度高的固定化方法。采用基因工程技术克隆目的酶基因与亲和标签构建融合酶表达载体，转化到大肠杆菌、酵母等表达系统中进行表达，然后利用亲和载体固定化融合酶，是一种高效固定化酶的新技术。如能科学设计，构建和高效表达带亲和标记融合酶，并探寻出价格低廉、来源丰富的不溶性载体，然后利用融合酶的亲和标签与不溶性载体的强亲和力制备固定化酶，将具有很好的理论和实践意义。大多数纤维素降解酶包含三个结构域：纤维素结合结构域cellulose-bindingdomain，CBD、柔性连接区域和催化结构域JBiolChem,1992,267:6743-6749；JBacteriol,1993,175:5762-5768；BioresourTechnol,2011,102:2910-2915。纤维素相对便宜，化学惰性，对大多数蛋白质具有较低非特异性亲和力，在商业上可以以多种不同的形式存在。因此，利用CBD的纤维素结合模块cellulose-bindingmodule，CBM可以与纤维素特异和不可逆的结合的特性，可将CBM开发为亲和标签，构建融合蛋白，与纤维素发生亲和吸附制备固定化酶IntJMolSci,2012,13:358-368；BiotechnolProg,2009,25:68-74；JIndMicrobiolBiotechnol,2008,35:1455-1463。虽然，在理论上可借鉴CBM亲和标签在其他酶上的应用的思路，然而由于不同酶的结构和基因差异性很大，在CBM-融合酶的构建和高效表达方面尚无可直接复制方法，CBM-融合酶能否高效表达、表达成本和安全性等诸多因素仍是制约该项技术发展的关键和瓶颈。与其他基因工程菌的研究和开发一样，CBM-融合酶的构建和表达也需要针对个案进行科学设计和构建，才能获得有益效果。不同来源的GAD在结构上存在巨大差异，即使同属微生物，不同菌株的GAD的亚基组成和分子量等方面都具有巨大差异。例如，EscherichiacoliGAD含有6个相同的亚基，分子量为53kDaBiochemistry,1970,92:226-232；肺炎链球菌StreptococcuspneumoniaGAD与哺乳动物GAD65亚基分子量54kDa和序列相似59％相似，28％一致FEMSMicrobiolLett,1995,1331-2:113-138；粗糙脉孢菌NeurosporacrassaGAD亚基的测定分子量约为33kDa，动力学性质与E.coliGAD相似TheJournalOfBiologicalChemistry,1991,2668:5135-5139；产气荚膜杆菌ClostridiumperfringensGAD分子量为290kDaBiochemJ,1970,118:135-141；短乳杆菌LactobacillusbrevisGAD有两个亚基，亚基分子量为60kDaBiosciBiotechBiochem,1997,617:1168-1171；乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcuslactissubsp.lactis的GAD只有一个亚基，亚基分子量大约为54kDaMicrobiology,1999,145:1375-1380，然而虽然乳酸乳球菌LactococcuslactisSYFS1.009的GAD同样也只有一个亚基，但是亚基分子量为65kDa许建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月，说明即使同种微生物的不同亚种的GAD之间也存在一定差异。因此，现已报道的利用CBM作为亲和标签固定化微生物酶的方法并不一定适合屎肠球菌GAD，需要针对特定微生物的特定酶开展研究，探讨适宜的方法。由上分析可见，虽然在理论上利用CBM与纤维素特异的、不可逆的结合特性，通过构建和表达带CBM标签的融合蛋白的途径实现CBM-融合蛋白的固定化，但是在实践上尚存在诸多不可预判性：1能否克隆到目的菌株的gadB基因？微生物gadB基因存在多样性，是否可以采用同种技术在不同的大肠杆菌表达系统中表达？2构建的CBM-GAD融合酶重组载体质粒是否科学可行？能否在大肠杆菌表达系统中高效表达CBM-GAD融合酶？3CBM与GAD融合表达后，CBM是否会改变GAD的折叠结构，从而改变GAD的活力或性质？4什么载体的价格较低廉、来源丰富并可与CBM-GAD融合酶牢固结合？载体需要如何改性？固定化酶是否稳定，其半衰期能否满足生产需求？由此可见，在技术的研发上仍需要根据具体的微生物GAD情况解决上述的关键问题。在专利申请CN201710510283.8中，发明人已从泡菜中分离筛选到高GAD活力的EnterococcusfaeciumLNSF2，并对该野生株进行了专利菌种保藏，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNO.60203。发明内容本发明要解决的技术问题是克服野生株GAD表达量普遍不高、活力低，游离酶难以回收，固定化难、半衰期短、无法重复利用和连续化生产，成本居高不下，难以满足GABA或DL-Glu工业化生产需要的问题，提供一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌，并提供一种高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的固定化方法。本发明通过以纤维素结合模块基因cbm3、屎肠球菌GAD基因gadB和自行构建的pRPOCB表达载体共同构建能高效表达携带纤维素结合模块CBM的屎肠球菌GAD融合酶CBM-GAD的工程菌，发酵培养制备CBM-GAD，通过CBM与改性甲壳素Modifiedchitin，MC进行特异性亲和吸附，即可获得MC-CBM-GAD不溶性固定化酶，最终实现高效固定化屎肠球菌GAD的目的，解决了GAD固定化难、半衰期短、成本高的问题。本发明的第一个目的是提供一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌。本发明的第二个目的是提供构建上述基因工程菌的方法。本发明的第三个目的是提供上述基因工程菌在高效固定化屎肠球菌GAD或制备屎肠球菌GAD固定化酶中的应用。本发明的第四个目的是提供使用上述基因工程菌高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法。本发明的第五个目的是提供一种用于制备屎肠球菌GAD固定化酶的改性甲壳素不溶性载体的方法。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明以胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3、EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建pRPOCB-efagadB质粒，转化E.coliDH5ɑ构建工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1，通过培养和收集已高效表达CBM-GAD融合酶的E.coliDH5α-LNSF1菌体，在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中于冰水浴下超声波破碎提取CBM-GAD融合酶粗酶液，再与滤干的改性甲壳素混合进行亲和吸附即可获得甲壳素-CBM-GAD固定化酶。本发明中构建的pRPOCB质粒中的启动子PrpoS743bp包含了RpoS转录调控系统的5'-非翻译区，这个区域在细菌对胁迫条件的响应中起重要作用；启动子PrpoS不依赖于任何额外添加的诱导剂，能够有效地驱动外源蛋白在对数生长期的表达；使用不依赖于诱导剂的启动子驱动蛋白表达有利于降低成本；CBM是一种有效的蛋白质分离标签，能与改性甲壳素有特异性的吸附，在本发明中被用于重组蛋白的亲和吸附，从而获得屎肠球菌GAD固定化酶。本发明提供了一种构建用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌的方法，包括以下步骤：S1.克隆EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB；S2.构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3和T7终止子序列的大肠杆菌pRPOCB表达载体；S3.采用屎肠球菌gadB基因与pRPOCB表达载体构建重组质粒pRPOCB-efagadB；S4.将重组质粒pRPOCB-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞，构建表达CBM-GAD融合酶的工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1；其中，CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶。进一步地，在一个较佳地实施例中，所述大肠杆菌为EscherichiacoliDH5ɑ。所述工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60445，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1为：含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、EnterococcusfaeciumLNSF2谷氨酸脱羧酶基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCB-efagadB质粒。所述野生株EnterococcusfaeciumLNSF2分离自泡菜，该野生株已于2017年6月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60203，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；该菌株作为GAD的基因gadB来源菌株；采用E.coliDH5ɑ作为基因克隆和纤维素结合模块-谷氨酸脱羧酶CBM-GAD融合酶的表达系统；构建的工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1携带pRPOCB-efagadB质粒，pRPOCB-efagadB总长度为5130bp；在gadB基因前插入了纤维素结合模块基因cbm3，融合基因全长为1887bp；gadB基因自身长度为1401bp，氨基酸数目为466aa，理论分子量约为53710D；CBM-GAD融合酶全长628aa，理论分子量约为71522D。作为一种较佳的实施方案，构建用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌的方法，包括以下步骤：S1.EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB克隆：以efa-1、efa-2为引物，从EnterococcusfaeciumLNSF2基因组DNA中扩增获取gadB基因，纯化，与pMD19-TSimpleVector连接，构建重组质粒pMD-efagadB，转化大肠杆菌，测序；S2.大肠杆菌质粒pRPOCB构建：采用pUC57质粒、胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3和T7终止子序列构建获得pRPOCB质粒；S3.表达载体pRPOCB-efagadB构建：以pRPOCB为模板，设计引物Infu-22和Infu-27，PCR扩增制备线性化载体pRPOCB；设计引物Infu-13和Infu-24，以pMD-EfagadB为模板扩增gadB基因，纯化，将线性化载体pRPOCB与纯gadB基因进行组装，从而获得重组质粒pRPOCB-efagadB；S4.工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1构建：将重组质粒pRPOCB-efagadB转化E.coliDH5ɑ感受态细胞，构建出可表达CBM-GAD融合酶的工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1；其中，CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶。相应地，所述基因工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1在高效固定化屎肠球菌GAD或制备屎肠球菌GAD固定化酶中的应用，也在本发明的保护范围之内。本发明还提供了使用上述基因工程菌高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法，包括以下步骤：S11.在冰水浴的条件下，于缓冲液中破碎EscherichiacoliDH5α-LNSF1菌体，提取CBM-GAD融合酶粗酶液；S12.将CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素混合并搅拌，发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-GAD，滤除液体，分离得到的固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶；所述CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶。优选地，步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性或经NaOH尿素混合溶液改性的甲壳素。更优选地，步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性的甲壳素。所述经浓磷酸改性的甲壳素的制备方法为：在冰浴下，用浓磷酸溶解甲壳素至混合物变透明，再用冰水稀释使甲壳素充分沉淀，收集甲壳素沉淀，然后用蒸馏水或结合Na2CO3溶液将甲壳素沉淀洗涤至中性，即可得到浓磷酸改性的甲壳素。优选地，步骤S11所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。利用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为CBM-GAD融合酶粗酶液提取的缓冲液，成本低、安全性高，克服了Tris-HCl缓冲液的缺点。优选地，步骤S11所述缓冲液的浓度为10～100mmolL。更优选地，步骤S11所述缓冲液的浓度为20mmolL。经过研究磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度对CBM-GAD融合酶粗酶液提取、以及CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素亲和吸附能力的影响，发现磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度为20mmolL时，离子强度适宜，提取的融合酶粗酶液对改性甲壳素的亲和吸附力比采用Tris-HCl缓冲液更优。优选地，步骤S11所述缓冲液的pH为7～8。更优选地，步骤S11所述缓冲液的pH为8。优选地，步骤S11所述破碎的方法为：在冰水浴中超声波破碎。优选地，步骤S12所述CBM-GAD融合酶粗酶液体积mL与所述滤干的甲壳素质量g的比例为3～5︰1。更优选地，步骤S12所述CBM-GAD融合酶粗酶液体积mL与所述滤干的甲壳素质量g的比例为4︰1。另外，作为一种较佳的实施方案，使用上述基因工程菌高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法，包括以下步骤：S11.CBM-GAD融合酶的表达：将EscherichiacoliDH5α-LNSF1接入培养基中，并置于振荡培养箱中培养，高效表达CBM-GAD融合酶；S12.提取CBM-GAD融合酶粗酶液：将用培养基发酵的发酵液离心收集菌体，搅拌分散洗涤菌体，再次离心收集菌体，按照湿菌体重量g与缓冲液体积mL比例为1︰15加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，在冰水浴的条件下超声波破碎细胞，离心，取上清液，即为CBM-GAD融合酶粗酶液；S13.制备屎肠球菌GAD固定化酶：将改性甲壳素以水浸泡，离心或过滤去除残余水分，将CBM-GAD融合酶粗酶液体积mL与滤干的改性甲壳素质量g的比例为4︰1的比例混合，间歇搅拌，使CBM-GAD融合酶与改性甲壳素充分发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-GAD，离心或过滤去除液体，分离得到的固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶。作为一种较佳的实施方案，所述经浓磷酸改性的甲壳素的制备方法为：在甲壳素中边搅拌边缓慢加入已于-7℃预冻的浓磷酸，冰浴，连续搅拌或间歇搅拌直至混合物变透明；再加入冰水稀释，充分沉淀甲壳素，离心或过滤收集甲壳素沉淀；加入冰水搅拌重悬洗涤甲壳素，重复2次，以洗除磷酸；然后再用蒸馏水搅拌重悬甲壳素，用Na2CO3溶液调节悬浮液pH接近中性，滤除液体；用蒸馏水洗涤甲壳素沉淀4次，即可得到经浓磷酸改性的甲壳素；所述浓磷酸为市售浓磷酸，磷酸浓度大于85％。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1本发明构建的基因工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1以具高GAD活力的野生株EnterococcusfaeciumLNSF2的优良gadB基因为基础，并且采用的启动子PrpoS包含RpoS转录调控系统的5'-非翻译区，不依赖于任何额外添加的诱导剂，能够有效地驱动外源蛋白在对数生长期的表达，CBM-GAD融合酶表达量高，GAD活力强，可降低CBM-GAD融合酶生产成本。2本发明在CBM-GAD融合酶提取时利用的缓冲液的成本低、安全性高，克服了Tris-HCl缓冲液成本高、安全性低的缺点；同时，得到的屎肠球菌GAD固定化酶活力高。3本发明选用的不溶性载体改性甲壳素的粒径较改性纤维素大，液体流动性更好，克服了改性纤维素的液体流动性差的缺陷；CBM通常作为纤维素结合标签，但是，本发明表明CBM对改性甲壳素的亲和性质比纤维素更强、结合更牢固；改性甲壳素吸附CBM-GAD融合酶的蛋白量达到626.98±61.74μgg，最终得到的屎肠球菌GAD固定化酶的活力达到5809.46±208.99Ug，固定化率大于98.13％。4本发明工程菌的构建设计科学合理，有机结合了CBM对甲壳素的强特异亲和性质，只需在常温常压下将改性甲壳素与CBM-GAD融合酶粗酶液充分混合，使CBM-GAD与甲壳素发生特异性吸附形成不溶性甲壳素-CBM-GAD，即可获得屎肠球菌GAD固定化酶；另外，以改性甲壳素与CBM-GAD融合酶制备屎肠球菌GAD固定化酶，其固定化效率高、得到的屎肠球菌GAD固定化酶的活力强、性能稳定、半衰期长，该固定化方法快捷、成本大大降低，解决了GAD固定化难、半衰期短和成本高等问题。附图说明图1是屎肠球菌GAD固定化的设计路线示意图；其中，1：纤维素结合模块编码序列cbm3，2：EnterococcusfaeciumLNSF2，3：EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB，4：pRPOCB表达载体，5：pRPOCB-efagadB重组质粒，6：EscherichiacoliDH5ɑ，7：CBM-GAD融合酶，8：改性甲壳素，9：屎肠球菌GAD固定化酶。图2是PCR扩增EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB的电泳图；其中，泳道M为DNA分子量标准Marker，泳道1为PCR扩增获得的EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB。图3是重组质粒pRPOCB-efagadB的结构示意图。图4是不同缓冲液对CBM-GAD融合酶粗酶液提取、以及CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素亲和吸附能力的影响；其中，PBS表示磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，GAD表示谷氨酸脱羧酶。图5是改性甲壳素固定化屎肠球菌GAD稳定性测试结果；其中，GABA表示γ-氨基丁酸，GAD表示谷氨酸脱羧酶。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明实施方式的基本路线是：以野生株EnterococcusfaeciumLNSF2为GAD基因gadB的供体，将纤维素结合模块基因cbm3、gadB基因和自行构建的pRPOCB表达载体进行重组构建pRPOCB-efagadB重组质粒，转化E.coliDH5ɑ构建工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1，培养表达CBM-GAD融合酶，再用改性甲壳素对CBM-GAD融合酶特异性固定化，从而得到MC-CBM-GAD固定化酶。基于上述发明实施方式的基本路线，设计的一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法的发明路线示意图如图1所示。在发明研究中，经对EnterococcusfaeciumGDMCCNo.60203的GAD基因gadB进行PCR扩增，获得的gadB电泳图如图2，从图2可见，gadB基因大小约为1.4kb，经测序gadB基因长度为1401bp，其核苷酸序列见SEQIDNO：7；构建的重组质粒pRPOCB-efagadB的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，结构示意图如图3所示；以重组质粒pRPOCB-efagadB转化E.coliDH5ɑ感受态细胞，构建出可高效表达CBM-GAD融合酶的工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1，LB培养基发酵表达的CBM-GAD的GAD活力达到了5920.17±212.97IUL。工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1的构建方法详见实施例1。在发明研究中，分别采用50mmolLTris-HCl缓冲液、100mmolLPBS缓冲液、50mmolLPBS缓冲液、20mmolLPBS缓冲液作为提取液提取CBM-GAD融合酶粗酶液，然后分别与磷酸改性甲壳素进行亲和吸附制备固定化酶，再经充分洗涤后测定各固定化酶的GAD活力，结果如图4。图4表明各缓冲液提取的CBM-GAD融合酶在一定程度上均能与甲壳素发生亲和固定化，经连续5批次的酶活力测定，固定化酶活力差异不大，说明各固定化酶均较稳定，但是20mmolLPBS缓冲液作为提取液的效果最佳，CBM-GAD融合酶与甲壳素亲和吸附量最多，GAD活力最大，GAD活力达到了5809.46±208.99Ug，固定化率大于98.13％，优于50mmolLTris-HCl缓冲液，效果最佳；50mmolL和100mmolLPBS缓冲液效果差异不大，固定化酶活力相对较低；结果表明缓冲液离子强度对甲壳素与CBM-GAD亲和吸附性能影响较大，说明高离子强度不利于甲壳素对屎肠球菌GAD的固定化。按照下述实施例4所述步骤制备屎肠球菌GAD固定化酶，即MC-CBM-GAD，以催化反应2h作为每批次的生产时间，对固定化酶MC-CBM-GAD在生物合成法生产GABA中的应用效果进行测试，结果如图5所示。从图5可见，重复生产使用22批次，固定化酶MC-CBM-GAD仍保持50％以上活力；重复生产使用25批次，固定化酶MC-CBM-GAD甲壳素固定化酶仍保持43％以上活力。由此可见，本发明利用改性甲壳素与CBM-GAD融合酶制备屎肠球菌GAD固定化酶的固定化效率高、得到的GAD固定化酶活力高、性能稳定、半衰期长，且固定化方法快捷、成本大大降低，解决了GAD固定化难、半衰期短和成本高等问题。具体实施方式示例如下：实施例1基因工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1的构建S1.将EnterococcusfaeciumLNSF2接入PSB或MRS培养基，于37℃静置培养12h，取培养液5mL以8500rmin离心，收集菌体沉淀，弃上清，按照康为世纪细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA，置于-20℃保存备用；设计efa-1和efa-2引物，引物efa-1和efa-2生物序列如表1所示，委托生工生物工程上海有限公司合成；以efa-1、efa-2为引物，以EnterococcusfaeciumLNSF2基因组DNA为模板，使用全式金TransStartFastPfuDNA聚合酶进行PCR反应；PCR反应条件为：95℃2min；95℃20s，50℃30s，72℃55s，循环33次；72℃5min；PCR反应结束后，按100μL体积加入1μLTaqDNAPolymerase，72℃反应30min，PCR产物的电泳结果如图2所示，可以看出，其产物的长度约为1400bp；然后用纯化试剂盒直接纯化gadB基因，将该基因与pMD19-TSimpleVector连接过夜，构建重组质粒pMD-efagadB，转化E.coliDH5ɑ感受态细胞，送生工生物工程上海股份有限公司测序，gadB基因的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，gadB基因长度为1401bp；S2.设计胁迫诱导型启动子PrpoS、cbm3源自Clostridiumthermocellum的家族3纤维素结合域编码序列、T7终止子序列，委托金斯瑞生物科技有限公司合成；将pUC57质粒先以NdeⅠHindⅡ酶切，然后将PrpoS、cbm3、T7插入pUC57拼接构建大肠杆菌质粒pRPOCB；其中，pUC57质粒、胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3和T7终止子的核苷酸序列分别如SEQIDNO：8～SEQIDNO：11所示；S3.设计和委托生工生物工程上海有限公司合成引物Infu-22和Infu-27，引物Infu-22和Infu-27的序列如表1所示，以pRPOCB为模板，使用全式金TransStartFastPfuDNA聚合酶进行PCR反应；PCR反应条件为：95℃2min；95℃20s，54℃30s，72℃1min45s，循环33次，72℃5min；PCR反应结束后，电泳切胶，用DNA胶回收试剂盒回收线性化载体pRPOCB，切下DNA条带，回收纯化目的片段；设计和委托生工生物工程上海有限公司合成引物Infu-13和Infu-24，引物Infu-13和Infu-24的序列如表1所示，以pMD-efagadB为模板扩增gadB基因，电泳切胶，回收纯化gadB基因；纯化后，将gadB基因与线性化载体pRPOCB用In-FusionHDCloningKit基因克隆试剂盒将其拼接起来，反应体系为In-fusion酶2μL、gadB基因1μL、线性化载体2μL、ddH2O5μL，总计10μL，离心30s，50℃连接15min，组装成重组质粒pRPOCB-efagadB，重组质粒pRPOCB-efagadB的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，其结构示意图如图3所示；S4.将重组质粒pRPOCB-efagadB转化E.coliDH5ɑ感受态细胞，构建出可高效表达CBM-GAD融合酶的工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1；表1构建基因工程菌EscherichiacoliDH5α-LNSF1所用的引物步骤S1所述PSB培养基组成为：蛋白胨15gL、牛肉膏10gL、蔗糖12.5gL、乙酸钠6.0gL、L-谷氨酸一钠10gL、吐温801.0gL，pH6.8～7.0；步骤S1所述MRS培养基组成为：蛋白胨15gL、牛肉膏12.5gL、蔗糖12.5gL、柠檬酸二铵2.0gL、乙酸钠5.0gL、K2HPO42.0gL、CaCl22.0gL、Tween801.0mLL、pH6.8～7.0。实施例2磷酸改性甲壳素固定化不溶性载体的制备SS1.在甲壳素中加入其质量3倍的蒸馏水，充分混合制备成甲壳素浆，在冰浴条件下，快速搅拌并缓慢加入甲壳素质量50倍的已于-7℃预冻的浓磷酸，搅拌至混合物变透明，冰浴1h不时搅动；SS2.在快速搅拌下分4次在步骤SS1得到的溶液中加入甲壳素质量500倍的冰水，静置30min使甲壳素充分沉淀，4℃、8500rmin离心15min，收集甲壳素沉淀；SS3.按甲壳素沉淀质量的20倍加入冰水，搅拌重悬，再于4℃、8500rmin离心15min，收集甲壳素沉淀，重复2次，以洗除磷酸；SS4.然后按甲壳素沉淀质量的20倍加入蒸馏水，搅拌重悬，用2molLNa2CO3调节pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甲壳素；SS5.再以甲壳素沉淀质量20倍的蒸馏水重悬洗涤甲壳素，重复洗涤4次，即为磷酸改性甲壳素MC，保存于4℃蒸馏水中，备用；步骤SS1所述浓磷酸为市售浓磷酸，磷酸浓度大于85％。实施例3NaOH尿素混合溶液改性甲壳素固定化不溶性载体的制备SS1.在甲壳素中加入其质量50倍的NaOH尿素混合溶液，搅拌混匀，-30℃冷冻4h，室温解冻并快速搅拌，然后再于-30℃冷冻4h，室温解冻并快速搅拌，重复冻融直至甲壳素溶解成透明状；SS2.边搅拌边在步骤SS1得到的溶液中加入甲壳素质量500倍的冰水，静置30min使甲壳素充分沉淀，4℃、8500rmin离心15min，去上清，收集甲壳素沉淀；SS3.用甲壳素沉淀20倍的蒸馏水重复洗涤甲壳素沉淀4次，以除去NaOH和尿素；SS4.在甲壳素沉淀中加入20倍的蒸馏水，搅拌重悬，采用1molLHCl调节pH接近中性，中和残余的NaOH尿素混合溶液，搅拌混匀，抽滤除去液体；SS5.以甲壳素沉淀质量20倍的蒸馏水重悬洗涤甲壳素，重复洗涤4次，即为NaOH尿素混合溶液改性甲壳素MC，保存4℃蒸馏水中，备用；步骤SS1所述NaOH尿素混合水溶液组成为NaOH110gL、尿素40gL。实施例4快速生产屎肠球菌GAD固定化酶S11.将实施例1构建得到的EscherichiacoliDH5α-LNSF1接入LB培养基，于37℃、120rmin振荡培养24h，高效表达CBM-GAD融合酶；S12.将EscherichiacoliDH5α-LNSF1发酵液于4℃、8500rm离心10min，收集菌体，加入生理盐水，搅拌分散洗涤菌体，再次离心收集菌体，按照湿菌体重量g与缓冲液体积mL比例为1︰15加入pH8.0、20mmolL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，冰水浴中400W超声波破碎细胞工作5s，冷却5s，全程50min，将细胞破碎液于8500rmin、4℃离心15min，取上清液，即为CBM-GAD融合酶粗酶液；S13.将实施例2得到的磷酸改性甲壳素MC离心或过滤去除残余水分，将CBM-GAD融合酶粗酶液与滤干的MC按体积与质量比为4︰1的比例混合，间歇搅拌30min，使CBM-GAD融合酶与改性甲壳素充分发生亲和吸附，形成MC-CBM-GAD，离心或过滤收集MC-CBM-GAD固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶；其中，步骤S11所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10gL，酵母粉5gL，NaCl10gL，L-谷氨酸一钠10gL，pH6.0；分装于规格250mL三角瓶，每瓶120mL，121℃灭菌20min；冷却后临用前，加入240μL50mgmL氨苄青霉素，摇匀。实施例5快速生产屎肠球菌GAD固定化酶本实施例按照实施例4快速生产屎肠球菌GAD固定化酶的过程，步骤S11和步骤S12与实施例4相同，步骤S13如下：S13.将实施例3得到的NaOH尿素混合溶液改性甲壳素MC离心或过滤去除残余水分，将CBM-GAD融合酶粗酶液与滤干的MC按体积与质量比为4︰1的比例混合，间歇搅拌30min，使CBM-GAD融合酶与改性甲壳素充分发生亲和吸附，形成MC-CBM-GAD，离心或过滤收集MC-CBM-GAD固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶。以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表岭南师范学院一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法12SIPOSequenceListing1.0125DNA人工序列ArtificialSequence1atgttatacggaaaagataatcaag25225DNA人工序列ArtificialSequence2ttagtgagtaaagccgtacgttttc25323DNA人工序列ArtificialSequence3gaattcctcgagggctcttccag23425DNA人工序列ArtificialSequence4ggatcccggttctttaccccaaacc25552DNA人工序列ArtificialSequence5gtttggggtaaagaaccgggatccatgttatacggaaaagataatcaagaag52642DNA人工序列ArtificialSequence6gccctcgaggaattcttagtgagtaaagccgtacgttttcac4271401DNA人工序列ArtificialSequence7atgttatacggaaaagataatcaagaagaaaaaaactatttggaaccaatttttggctct60gcaagtgaggatgttgacttgcctaaatataagttaaacaaagaatccattgaaccacga120attgcttatcaattagtacaagacgagatgttggatgaaggaaatgcgcgattaaactta180gctactttttgtcaaacgtatatggaacctgaagcagtgaaattgatgacccaaacgtta240gaaaaaaatgcaattgataaatcagaatacccacgaacaacggaaattgaaaaccgctgt300gtaaatatgattgctgatttatggcatgctccaaataatgaaaaattcatgggaacttca360acgatcggctcttcagaagcctgcatgctgggtggtatggccatgaaatttgcttggcgt420aaacgtgctgaaaaattaggtcttgatattcaagcaaaaaaacctaacctggtgatctct480tctggttaccaagtttgttgggaaaaattctgtgtatattgggatgtggaactgagagaa540gtcccaatggatgaaaaacatatgtcaattaatctagatactgtcatggattatgtggat600gagtacacaattggtattgtaggtattatgggtattacttacactggtcgttatgatgat660atcaagggtctgaatgatttagttgaagctcacaataaacaaactgactataaagtatac720attcatgttgacgctgcatcgggtggcttttatgcaccatttactgaacctgatctagtt780tgggattttcaattgaaaaatgttatctcaattaattcttcaggtcacaaatatggtttg840gtatatccaggtgtgggttgggtcttatggcgtgaccaacaatacttaccagaagaatta900gtatttaaagttagttacttaggtggagaaatgccaactatggctatcaacttctctcat960agtgcagcacaactaattgggcaatactacaactttgtacgctatggctttgatggttat1020cgtgatattcaccaaagaactcatgatgttgctgtttatttagccaaagagatcgaaaaa1080actggtatttttgaaatcattaatgatggatcagaattgccagttgtgtgctataagctg1140aaagaagatcccaatcgcgaatggacactatatgatttatctgatcgtctgttaatgaag1200ggatggcaagtcccagcctacccattacctaaagacttggatcaattaattattcaacgc1260ttagttgttcgagcagactttggaatgaacatggctggtgattatgtacaagatatgaac1320caagcaattgaagagttgaataaagctcatattgtttatcataaaaaacaggatgtgaaa1380acgtacggctttactcactaa140182710DNA人工序列ArtificialSequence8tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc180accatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcc240attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat300tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggt360tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaa420tgcatctagatatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggcg480taatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaac540atacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcaca600ttaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcat660taatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcc720tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactca780aaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagca840aaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccatagg900ctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg960acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt1020ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctt1080tctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc1140tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt1200gagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggatt1260agcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggc1320tacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa1380agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt1440tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttct1500acggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatta1560tcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaa1620agtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatc1680tcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataact1740acgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgc1800tcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagt1860ggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagta1920agtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg1980tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagtt2040acatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtc2100agaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctt2160actgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattc2220tgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataatacc2280gcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaa2340ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaac2400tgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaa2460aatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctt2520tttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaa2580tgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacct2640gacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgagg2700ccctttcgtc27109743DNA人工序列ArtificialSequence9ccatacgcgctgaacgttggtcagaccttgcaggtgggtaatgcttccggtacgccaatc60actggcggaaatgccattacccaggccgacgcagcagagcaaggagttgtgatcaagcct120gcacaaaattccaccgttgctgttgcgtcgcaaccgacaattacgtattctgagtcttcg180ggtgaacagagtgctaacaaaatgttgccgaacaacaagccaactgcgaccacggtcaca240gcgcctgtaacggtaccaacagcaagcacaaccgagccgactgtcagcagtacatcaacc300agtacgcctatctccacctggcgctggccgactgagggcaaagtgatcgaaacctttggc360gcttctgaggggggcaacaaggggattgatatcgcaggcagcaaaggacaggcaattatc420gcgaccgcagatggccgcgttgtttatgctggtaacgcgctgcgcggctacggtaatctg480attatcatcaaacataatgatgattacctgagtgcctacgcccataacgacacaatgctg540gtccgggaacaacaagaagttaaggcggggcaaaaaatagcgaccatgggtagcaccgga600accagttcaacacgcttgcattttgaaattcgttacaaggggaaatccgtaaacccgctg660cgttatttgccgcagcgataaatcggcggaaccaggcttttgcttgaatgttccgtcaag720ggatcacgggtaggagccacctt74310480DNA人工序列ArtificialSequence10atgccggtgtctggcaacctgaaagtggaattttacaacagcaatccgagcgatacgacc60aatagcatcaacccgcagtttaaagtgaccaacacgggtagctctgcaattgatctgtct120aaactgaccctgcgttattactatacggttgatggccagaaagaccaaaccttttggtgc180gaccatgcggccattatcggctctaacggtagttacaatggtatcacctcgaatgtcaaa240ggcacgttcgtgaaaatgagttcctcaaccaacaatgccgatacgtatctggaaattagc300tttaccggcggtacgctggaaccgggtgcacacgtccagatccaaggccgtttcgctaaa360aacgattggtcaaattacacccagtccaacgactattcatttaaatcggcgagccagttc420gttgaatgggatcaagtcaccgcctacctgaatggcgtgctggtttgggg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权利要求：1.一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌为Escherichiacoli（DH5α-LNSF1），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60445。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为：含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCB-efagadB重组质粒。3.一种构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.克隆EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB；S2.构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3和T7终止子序列的大肠杆菌pRPOCB表达载体；S3.采用屎肠球菌gadB基因与pRPOCB表达载体构建重组质粒pRPOCB-efagadB；S4.将重组质粒pRPOCB-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞，构建表达CBM-GAD融合酶的工程菌Escherichiacoli（DH5α-LNSF1）；其中，CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶。4.权利要求1或2所述基因工程菌Escherichiacoli（DH5α-LNSF1）在高效固定化屎肠球菌GAD或制备屎肠球菌GAD固定化酶中的应用。5.一种使用权利要求1或2所述基因工程菌高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S11.在冰水浴的条件下，于缓冲液中破碎Escherichiacoli（DH5α-LNSF1）菌体，提取CBM-GAD融合酶粗酶液；S12.将CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素混合并搅拌，发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-GAD，滤除液体，分离到的固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性或经NaOH尿素混合溶液改性的甲壳素。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性的甲壳素。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述经浓磷酸改性的甲壳素的制备方法为：在冰浴下，用浓磷酸溶解甲壳素至混合物变透明，再用冰水稀释使甲壳素充分沉淀，收集甲壳素沉淀，然后用蒸馏水或结合Na2CO3溶液将甲壳素沉淀洗涤至中性，即可得到浓磷酸改性的甲壳素。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S11所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S11所述缓冲液的浓度为10～100mmolL。

百度查询： 岭南师范学院 一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法

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