申请/专利权人：南京市计量监督检测院

申请日：2022-12-26

公开（公告）日：2024-03-15

公开（公告）号：CN115980336B

主分类号：G01N33/531

分类号：G01N33/531;G01N33/68;C07K14/55;C12N15/70;C12P21/06;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/36;C07K1/14;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86;G01N30/88;G01N27/447

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.15#授权;2023.05.05#实质审查的生效;2023.04.18#公开

摘要：本发明公开了一种白介素‑2标准品及其制备方法，包括如下步骤：1白介素‑2样品的制备；2白介素‑2样品的纯化；3白介素‑2样品的稀释；4白介素‑2的表征；5白介素‑2标准品含量标准值的测定。本发明制备方法制得了高纯度标准品蛋白样品，并且保证了样品的活性。并采用氨基酸的同位素稀释质谱法对样品进行定值，保证量值结果的准确性。本发明所制得的人白介素‑2标准品可用于制药质量控制环节，保证药品性能评价的关键参数测量结果的准确性。

主权项：1.一种白介素-2标准品的制备方法，其特征在于：所述白介素-2标准品的纯度大于98%，标准品的量值溯源至SI基本单位千克和摩尔mol；其制备方法具体包括以下步骤：（1）白介素-2样品的制备：以大肠杆菌重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，进行裂解，收集上清和沉淀；所述大肠杆菌氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；（2）白介素-2样品的纯化：采用分子筛和离子交换对样品进行纯化，得到白介素-2标准品候选物，具体操作如下：采用GEAvant25蛋白纯化工作站，采用SephadexG75凝胶柱，采用PBS洗脱，UV210nm监测流出信号，收集主峰；然后每次取1mL，上样至蛋白纯化系统，层析柱为HiTrapQ，监测波长210nm，缓冲浓溶液为Tris-HCL，洗脱液为4MNaCL溶液，收集主峰；（3）白介素-2样品的稀释：将白介素-2标准品候选物用PBS溶解，稀释到浓度为0.01～0.1mgg，得到稀释的白介素-2标准品候选物溶液；（4）白介素-2标准品的理化性质表征（4a）采用蛋白纯化分析方法对白介素-2标准品候选物的纯度进行表征；白介素-2纯度分析方法为SDS-PAGE凝胶电泳法、反相高效液相色谱法和凝胶排阻高效液相色谱法；SDS-PAGE凝胶电泳法的操作步骤如下：取50μLIL-2溶液与等体积的1X电泳上样缓冲液混合，沸水浴5min，上样10μL，采用预制胶进行分离，电泳电压80v，电泳时间1h；电泳完成后，考马斯亮蓝进行染色，染色完成后，甲醇-乙酸溶液进行脱色成像；反相高效液相色谱法操作步骤如下：IL-2纯品溶于0.1%甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mgmL，经0.22μm滤膜过滤，经UPLC分析；色谱柱为ACQUITYUPLCProteinBEHC4Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1pkg；柱温40℃，流动相A：0.1%TFA水，流动相B：0.075%TFA，71.4%乙腈，28.6%水，流速0.2mLmin，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长220nm，洗脱梯度：0～50min，40～100%B，50～54min，100%B，60～65min，40%B，面积归一化法计算纯度；高效液相色谱-凝胶排阻色谱的操作步骤如下：IL-2纯品溶于0.1%甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mgmL，经0.22μm滤膜过滤，经HPLC分析；色谱条件：色谱柱为XbridgeBEH125SEC3.5μm7.8×300mm色谱柱，柱温：室温，流动相：8gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4，1.44gNa2HPO4，pH7.2；流速0.5mLmin，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长210nm，280nm；面积归一化法计算纯度；（4b）采用质谱法对白介素-2标准品候选物的分子量进行测定，测定结果与理论分子量相吻合；白介素-2相对分子质量测定方法为：采用飞行时间串联质谱对完整蛋白的分子量进行检测，样品溶于0.1%甲酸水溶液，配置浓度为1.0mgmL；色谱柱为ACQUITYUPLCProteinBEHC4Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1pkg；柱温80℃，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.3mLmin；洗脱梯度：0～1.00min，15%B；1.00～8.00min，15～80%B；11.50～15.00min，15%B；进样量2μL；质谱条件：正离子扫描，扫描范围：600～5000Da，离子源温度：350℃，去簇电压275v，碰撞能10V；（4c）对白介素-2标准品候选物的蛋白质进行鉴定；采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，然后通过BioPharmaFinder软件进行分析，结果应当与蛋白的序列对应的蛋白质一致；其前处理方式为：1）润洗：加入100uL50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；2）溶液置换：16000r离心10min，100μL浓度为1μguL的样品加入超滤管滤膜；3）变性：加入100μL7M盐酸胍变性；4）还原：加入4μL1MDTT置于42℃恒温1h；5）烷基化：加入10μL1MIAA室温避光30min；6）离心，加入100μL50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，直至超滤膜上的溶液离心至干，重复三次；7）酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；8）倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1%；鉴定所用分析软件为BioPharmaFinder，液相条件：预柱：AcclaimPepMapTM10075μm×2cm，nanoViper2PkC18，3μm，100A；色谱柱：AcclaimPepMapTMRSLC50μm×15cm，nanoViperC18，2μm，100A；柱温：室温，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈水溶液，80%乙腈；洗脱梯度：0～3min，3%B；3～28min，3～30%B；28～86min，30～50%B；86～88min，50～99%B；90min，99%B；流速300nLmin，进样量1μL；质谱条件：正离子扫描，扫描范围：200～2000Da，分辨率：15000，带点：1-6；（4d）白介素-2二硫键分析：采用高分辨质谱对二硫键进行表征，保证二硫键的正确连接方式；采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，对二硫键进行分析；其前处理方式为：1）润洗：加入100uL50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；2）溶液置换：16000g离心10min，100μL浓度为1μguL的样品加入超滤管滤膜；3）变性：加入100uL7M盐酸胍变性；4）离心：加入100uL50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，直至超滤膜上的溶液离心至干，重复三次；5）酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；6）倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1%；鉴定所用分析软件为BioPharmaFinder，液相条件：预柱：AcclaimPepMapTM10075μm×2cm，nanoViper2PkC18，3μm，100A；色谱柱：AcclaimPepMapTMRSLC50μm×15cm，nanoViperC18，2μm，100A；柱温：室温，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈水溶液，80%乙腈；洗脱梯度：0～3min，3%B；3～28min，3～30%B；28～86min，30～50%B；86～88min，50～99%B；90min，99%B；流速300nLmin，进样量1μL；质谱条件：正离子扫描，扫描范围：200～2000Da，分辨率：15000，带点：1-6；（4e）采用毛细管等电聚焦电泳法对白介素-2的等电点测定，测得等电点应与理论值一致；基于等电点差异分析的毛细管等电聚焦电泳方法测定白介素-2样品的等电点，所配检测器为紫外检测器，检测器波长为280nm，NCHO涂层毛细管50μmI.D.数据处理软件为32KaratTM软件；（5）基于氨基酸分析的高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定白介素-2的含量选择苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸的同位素标记方法进行定值；用分析天平准确称量100mg稀释后白介素-2溶液于安踣瓶中，按质量比1∶1分别加入提前配制的标记的缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的混合标准溶液，准确称量，记录数据；混匀后，于离心浓缩仪，离心浓缩至干，取出加入800μL6molLHCL，涡旋混合均匀后，通氮密封，于110℃烘箱中水解48h，通氮吹干，0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22μm滤膜进行测定；液相条件：色谱柱：ACQUITYUPLCPeptideBEHC18Column，130A，1.7μm，2.1mm×100mm，1pkg，柱温30℃，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈，洗脱梯度：0～10min，5～95%B，10～14min，95%B，14.10～16min，5%B，流速0.2mLmin，进样量2μL；氨基酸水解的质谱分析条件如下表所示： ID Q1 Q3 DP，V CE，V Phe 166.1 120.1 50 19 Pro 116.1 70.0 50 23 Val 118.10 72.10 40 16 13C9-Phe 175.1 128.1 50 19 13C5-Pro 121.0 74.1 50 22 13C5-Val 123.10 76.10 40 15 采用以下公式计算合成的特征肽段的含量， ，其中，CAA：白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度，mgg；P：氨基酸标物纯度；m标：样品中加入标记氨基酸的质量，mg；R样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记标记；I1：低标氨基酸实际质量比，非标记标记；I2：高标氨基酸实际质量比，非标记标记；R1：低标氨基酸峰面积比，非标记标记；R2：高标氨基酸峰面积比，非标记标记；M：平行样中白介素-2样品溶液的质量，g； ，其中，CIL-2：白介素-2的浓度，mgg；MIL-2：白介素-2的相对分子质量；CAA：计算出的白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度，mgg；n：白介素-2样品中氨基酸个数；MAA：Phe、Val、Pro的相对分子质量；白介素-2的浓度取Phe、Val、Pro计量出得IL-2的平均浓度。

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百度查询： 南京市计量监督检测院 一种白介素-2标准品及其制备方法

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