申请/专利权人：中国石油大学(华东)

申请日：2022-05-17

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN115097130B

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N21/78

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2022.10.14#实质审查的生效;2022.09.23#公开

摘要：本发明公开了一种快速定性‑定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，具体涉及生物医药分析检测技术领域。该检测方法同时提供了一种毛细玻璃管内表面抗体的偶联方法和与毛细玻璃管结合起到信号放大以提高检测灵敏度的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2。该检测方法利用毛细玻璃管作为载体，将毛细玻璃管内壁偶联目标待测物抗体，基于纳米材料Fe3O4@MoS2的光热效应和拟酶特性，将目标待测物抗体修饰到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2使其可以特异性捕获目标待测物，为提高检测方法的灵敏度奠定基础，而且简化了目前新型冠状病毒的复杂检测过程，缩短了检测时间，且无需专业操作人员，成本较低，有望实现基层化推广。

主权项：1.一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，目标待测物为新型冠状病毒SARS-CoV-2，用于非治疗目的，所述方法包括以下步骤：S1毛细玻璃管内壁偶联目标待测物抗体，具体操作方法为：S1.1毛细玻璃管内壁表面预处理先用清洁剂和去离子水对毛细玻璃管内壁超声清洗，超声清洗时间10min，毛细玻璃管干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面羟基化过程是在Piranha溶液中反应时间为2h，反应温度为37℃，乙醇和去离子水水超声清洗时间为5min，干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面氨基化过程是将羟基化毛细玻璃管置于APTES的乙醇溶液中密闭反应，反应时间2.5h，反应温度为40℃，然后将多余溶液去除，将毛细玻璃管用乙醇超声清洗5min，再用去离子水冲洗3次，干燥温度为80℃，干燥时间1h，再用N2吹扫10min；所述S1.1中，所用Piranha溶液是98vol%H2SO4和30vol%H2O2按体积比7:3混合制得；APTES的乙醇溶液体积比为APTES：乙醇：水=1：10：0.3；S1.2毛细玻璃管内壁表面抗体的偶联将目标待测物抗体加到聚苯乙烯样品管中，将S1.1处理好的毛细玻璃管插到抗体溶液中吸取抗体溶液孵育，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1溶液的用量为10μL，浓度为3.0μgmL；孵育条件为37℃，孵育时间为1.5h；用BSA封闭处理，封闭液BSA用量为20μL，浓度为2%；用缓冲液冲洗毛细玻璃管，洗去未结合的抗体，PBS缓冲液浓度为0.01molL，冲洗3次；S2制备免疫纳米材料Fe3O4@MoS2将目标待测物抗体加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中反应，反应条件为室温震荡反应8h，纳米材料Fe3O4@MoS2用量为1ml，浓度为1mgmL，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，用量为10μL，加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中所形成的浓度为10.0μgmL；反应后加入BSA溶液封闭，缓冲液洗涤，BSA封闭液用量为200μL，浓度为2%，封闭时间30min；用PBS缓冲液浓度为0.01molL，洗涤3次，得到抗体-Fe3O4@MoS2的复合物，即免疫纳米材料Fe3O4@MoS2，得到的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2在4℃保存；S3检测目标待测物，具体操作方法为直接检测法：直接检测法分为定量检测目标待测物或定性检测目标待测物：定量检测目标待测物SARS-CoV-2：将S1制得的内表面修饰有SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1的毛细玻璃管插入到SARS-CoV-2样本溶液中室温孵育5min，用0.01molL的PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到SARS-CoV-2刺突蛋白的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中室温孵育5min，用0.01molL的PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用808nm激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度升高值ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白溶液浓度建立标准工作曲线，用于SARS-CoV-2定量检测；即根据公式ΔT=ΔT1-ΔT0，建立ΔT与目标待测物浓度的标准工作曲线；其中，ΔT为温度升高值，ΔT0为空白样品激光照射前后温度升高值，ΔT1为添加目标待测物样品后激光照射前后的温度升高值；直接检测法定量检测的总检出时间为11min；定性检测目标待测物：将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到目标待测物溶液中孵育，用PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到目标待测物的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色变化，用于目标待测物定性检测；所述TMB显色液由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、H2O2和醋酸缓冲溶液组成；其中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为0.6mmolL、H2O2浓度为2.5mmolL、醋酸缓冲溶液为0.01molL，pH值为4.00，显色时间为20min。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国石油大学(华东) 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法

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