申请/专利权人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

申请日：2023-05-25

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN116656730B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/39;C12N15/47;C12N15/65;C12N15/90;C12N15/113;C12N7/01;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2023.09.15#实质审查的生效;2023.08.29#公开

摘要：本发明公开了一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法，相较于传统的同源重组方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3‑5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，大大减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程，缩短了获得重组病毒的时间，提高了效率。通过本发明方法构建的重组金丝雀痘病毒，相较于原始病毒基因组替换了串联表达的基因，可以同时表达狂犬病病毒G和M蛋白，并在感染细胞时形成病毒样颗粒，因此可为狂犬病免疫预防提供候选疫苗株，应用于疫苗免疫时可以发挥其免疫效应，拓展了CRISPRCas9技术的应用范围，为狂犬病病毒疫苗开发提供了新的方向。

主权项：1.一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗FerretDistemper，所述重组金丝雀痘病毒为利用CRISPRCas9基因编辑技术将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白的编码基因插入所述金丝雀痘病毒的基因组C6编码区而得；构建方法包括如下步骤：S1、利用CRISPRCas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因、下游同源臂C6R构成；上游同源臂C6L的序列如SEQIDNo.1所示，分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白的基因序列如SEQIDNo.2所示，下游同源臂C6R的序列如SEQIDNo.3所示；步骤S1的具体过程如下：细胞铺至六孔板，利用CRISPRMAXTMCas9转染质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染含有同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；其中，质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2的获得过程如下：1.1、确定小向导RNAC6gRNA及其引物序列：小向导RNAC6-sgRNA-1及其引物序列：C6-sgRNA-1-F：5’-CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC-3’C6-sgRNA-1-R：5’-CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC-3’C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-1-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA-1的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；小向导RNAC6-sgRNA-2及其引物序列：C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；1.2、C6gRNA-1oligo二聚体的形成：将C6gRNA-1-F、C6gRNA-1-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；1.3、oligo二聚体插入到Cas9gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；1.4、转化：将步骤1.3得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1；1.5、C6gRNA-2oligo二聚体的形成将C6gRNA-2-F、C6gRNA-2-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；1.6、oligo二聚体插入到Cas9gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.5中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；1.7、转化：将步骤1.6得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-2；S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白的重组金丝雀痘病毒。

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