申请/专利权人：中国医学科学院医学生物学研究所

申请日：2020-11-30

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN112391346B

主分类号：C12N5/079

分类号：C12N5/079

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2021.03.12#实质审查的生效;2021.02.23#公开

摘要：本发明涉及一种非酶消化法获取树鼩大脑星形胶质细胞的分离培养方法，属于细胞分离培养技术领域。本发明以gentleMACS全自动组织处理器解离脑组织，消化传代时用TrypLEExpress替代常用的胰酶来消化树鼩大脑星形胶质细胞，并含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基进行培养。通过本发明方法可以轻松的实现树鼩大脑星形胶质细胞的体外分离培养，进一步简化了分离方法，缩短周期，减轻细胞伤害，分离效率大大提高，星形胶质细胞特异性标志物‑胶质纤维状酸性蛋白免疫荧光染色率高，能够满足医学、生物学等研究领域对星形胶质细胞相关实验研究的要求。

主权项：1.一种非酶消化法获取树鼩大脑星形胶质细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），树鼩大脑皮层的分离：取1只新生1日龄树鼩的大脑皮层，转入无菌培养皿中，无菌操作剔除残留的包膜和血管，用含1%双抗的PBS反复冲洗3-5次；步骤（2），制备单细胞悬液：将步骤（1）分离的树鼩大脑皮层加入到1mL含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基中，解离组织后，离心，收集细胞；步骤（3），细胞培养：在超净工作台上，将步骤（2）中离心得到的细胞加入含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基重悬细胞；将细胞悬液过滤，过滤得到的细胞加入16mL含10%胎牛血清、1%双抗的DMEMF12完全培养基，将细胞反复吹打混匀，在37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液；培养3-5d后进行星形胶质细胞分离纯化；步骤（4），星形胶质细胞分离纯化：吸弃旧培养基，用含1%双抗的PBS冲洗1-2次；加入1mlTrypLEExpress进行消化，用含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基终止消化，反复吹打均匀，按1:2的比例进行传代；在37℃、5%CO2条件下，培养30-60min，将未贴壁的细胞连同培养基一起转入新的培养瓶中，37℃、5%CO2培养2-3d；重复步骤（4）2-3次，即可完成星形胶质细胞的传代和纯化培养；步骤（2）中的具体方法为：将步骤（1）分离的树鼩大脑皮层转入gentleMACS（TM）全自动组织处理器专用C管，加入1mL含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基，旋紧盖子，将C管倒置在gentleMACS全自动组织处理器上，开机后先选择程序解离组织，程序结束后，迅速将C管转入离心机，离心，收集细胞；含10%胎牛血清、1%双抗DMEMF12完全培养基采用的DMEMF12完全培养基为液体基础培养基，并在液体基础培养基中加入胎牛血清至体积浓度为10%，加入青霉素至浓度10Kuml，加入链霉素至浓度10mgml；含1%双抗的PBS中青霉素含量为100Uml，链霉素含量为0.1mgml；步骤（1）中，树鼩脑组织的大脑皮层的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得；在gentleMACS全自动组织处理器上，开机后先选择程序m_brain_02_02解离31s，再选择程序m_spleen_03_02解离16s。

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