申请/专利权人：扬州大学

申请日：2021-11-01

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN114395583B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/40;C12N15/53;C12N7/01;C12Q1/04;C12Q1/70;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2022.05.13#实质审查的生效;2022.04.26#公开

摘要：本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussialuciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。

主权项：1.表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆在抗病毒药物筛选中的应用，所述表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的构建方法如下：1将SEQIDNO:1所示序列克隆至pACYC177质粒中的AscI和BglI位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-vector；2以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的RNA的反转录产物cDNA为模板，分别用F1-FF1-R、F2-FF2-R、F3-FF3-R和F4-FF4-R进行扩增，扩增得到F1、F2、F3、F4四个片段；3将步骤2得到的F1、F2、F3、F44个片段克隆至重组质粒pCMV-TA-vector中，得到重组质粒pCMV-TA-12；4以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-EcoRV-FTA-12-dBsrGI-R和TA-12-dBsrGI-FTA-12-BsrGI-R分两段扩增，得到F5、F6两个片段，利用体外同源重组，将回收纯化后的F5、F6替换pCMV-TA-12中的相对应区域，得到含有遗传标记的感染性克隆质粒pCMV-TA-12M；5以pCMV-Gluc质粒为模板，用引物TA-12-TRS6Gluc-F和TA-12-GlucUTR-R扩增Gluc基因序列；以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-BsrGI-FTA-12-NTRS6-R和TA-12-GlucUTR-FTA-12-NotI-R分别扩增A和B片段，回收纯化后Gluc基因序列、A和B片段，利用体外同源重组将Gluc基因序列、A和B片段替换pCMV-TA-12M中BsrGI和NotI位点之间的病毒序列，得到感染性克隆质粒pCMV-TA-Gluc，即表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆；步骤2中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的RNA的反转录产物cDNA的序列如SEQIDNO：2所示；步骤3中，所述重组质粒pCMV-TA-12的构建方法如下：将回收纯化后的F1和F2片段插入至pCMV-TA-vector中的MluI和AflII位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-F1～F2；将回收纯化后的F3和F4片段插入至pCMV-TA-F1～F2中的AflII和EcoRI位点之间，得到感染性cDNA克隆质粒pCMV-TA-12；上述引物序列见下表：

全文数据：

权利要求：

百度查询： 扬州大学 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD