申请/专利权人：江南大学

申请日：2022-02-22

公开（公告）日：2024-03-26

公开（公告）号：CN114426968B

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10;C12N15/75;C12N15/65;C40B50/06;C12R1/125

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.26#授权;2022.05.20#实质审查的生效;2022.05.03#公开

摘要：本发明公开了一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用，属于基因工程技术领域。枯草芽孢杆菌B.subtilis是工业中常用的外源蛋白生产菌株，通过构建cDNA文库是筛选枯草芽孢杆菌功能基因的有效方法，本发明将外源蛋白基因与B.subtilis168cDNA文库共表达，以pAD123质粒为模板，通过同源重组的方法替换麦芽糖诱导型启动子Pglv，该pAD123‑Pglv质粒用于表达B.subtilis全长cDNA。外源蛋白基因由pUB110质粒表达。本发明为原核生物cDNA文库的构建提供技术参考，同时为B.subtilis功能基因的筛选鉴定提供了基础。

主权项：1.一种构建枯草芽孢杆菌全长cDNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：提取枯草芽孢杆菌的总RNA，并去除总RNA中的rRNA；S2：对S1中去除rRNA的总RNA进行体外腺苷酸化并进行纯化获得PolyA+RNA；S3：利用具有末端转移活性的逆转录酶将S2中的PolyA+RNA反转录成单链cDNA，并用与逆转录酶末端转移活性生成碱基互补配对的寡合苷酸标记单链cDNA的3’末端；S4：将S3中的单链cDNA在PCR引物和锚定引物的引导下合成并扩增cDNA第二条链，纯化富集片段大小≥500bp的双链cDNA；S5：将S4中的双链cDNA连接到质粒上并转化至大肠杆菌，获得枯草芽孢杆菌全长cDNA文库；连接到质粒上的cDNA长度≥1.5kb；S2中采用PolyA聚合酶进行体外腺苷酸化反应；S3中的反转录的引物的序列如SEQIDNO.1所示，S4中的PCR引物的序列如SEQIDNO.2所示，锚定引物的序列如SEQIDNO.3所示；S5中所述质粒包括pAD123。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江南大学 一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用

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