申请/专利权人：江苏鼎泰药物研究(集团)股份有限公司

申请日：2022-09-30

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN117805254A

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;G01N30/86;G01N30/88

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.19#实质审查的生效;2024.04.02#公开

摘要：本发明提供一种肝微粒体体系中4‑羟基双氯芬酸浓度的UPLC‑MSMS分析检测方法。首先，摸索并建立合理的肝微粒体孵育体系；其次，对4‑羟基双氯芬酸在肝微粒体中浓度测定进行方法开发与摸索，优化色谱和质谱条件、确定生物样品前处理方式，同时对其进行方法学验证；最后进行样品测定，得到特定孵育样品在肝微粒体体系中4‑羟基双氯芬酸浓度。本发明的检测方法灵敏度高，稳定性好、精确，且提高了分析效率。

主权项：1.一种肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度的UPLC-MSMS分析检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1、建立肝微粒体温孵体系在PBS缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物进行预孵育，之后加入还原型辅酶Ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；S2、标准曲线样品及待测样品的配制根据步骤S1中建立的肝微粒体温孵体系，将系列浓度的4-羟基双氯芬酸、混合的人肝微粒体、氯化镁溶液以及还原型辅酶Ⅱ混合，配制系列浓度的标准曲线样品溶液；按照步骤S1中的建立肝微粒体温孵体系，在PBS缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及10μM的双氯芬酸底物进行预孵育，之后加入还原型辅酶Ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中进行温孵，温孵结束后得到待测样品溶液；S3、样品进样前处理在步骤S2得到的标准曲线样品溶液和待测样品溶液中加入内标工作溶液终止反应，涡旋、振荡、离心，取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入超纯水溶液复溶，封膜、摇板；S4、UPLC-MSMS分析检测将步骤S3处理后的样品进行UPLC-MSMS分析检测，其中，色谱检测条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；洗针液：异丙醇甲醇乙腈超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；色谱柱：ACQUITYUPLCHSST3；流速：0.5mLmin；保留时间：4-羟基双氯芬酸：1.34min；Tolbutamide：1.33min；洗脱时间：2.5min；色谱洗脱程序为：0～0.30min流动相B的体积百分数为20％，0.30～1.00min流动相B的体积百分数为20％升至90％，1.00～2.10min流动相B的体积百分数为90％，2.10～2.11min流动相B的体积百分数为90％降至20％，2.11～2.50min流动相B的体积百分数为20％；质谱条件为：质谱离子源：ESI电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：MRM多反应离子监测；碰撞气：Medium；气帘气：35psi；分辨率Q1Q3：UnitUnit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500V；离子化温度：550℃；采集时长：2.50min；根据检测结果得到4-羟基双氯芬酸的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的4-羟基双氯芬酸浓度。

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权利要求：

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