申请/专利权人：大连工业大学

申请日：2023-12-29

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN117844893A

主分类号：C12P33/00

分类号：C12P33/00;C12N1/14;C12R1/645

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.26#实质审查的生效;2024.04.09#公开

摘要：本发明公开了一种基于高含量人参皂苷提高稀有皂苷转化率的方法，包括如下步骤：1桦褐孔菌的采集、预处理；2桦褐孔菌的分离纯化、诱变与筛选；3人参不定根的诱导培养与增殖培养；4人参不定根的生物反应器培养；5人参不定根的Ge‑Gly培养基培养，Ge‑Gly培养基培养分为两个阶段，第一阶段培养为Ge‑Gly培养基单独的培养，第二阶段培养为Ge‑Gly培养基与桦褐孔菌菌株联合培养。本发明将Ge和Gly螯合反应得到的Ge‑Gly反应液作为Ge‑Gly培养基成分，Ge‑Gly螯合物可快速被人参不定根吸收，进而使得皂苷含量明显提高，同时加入药用真菌桦褐孔菌，产生β‑葡萄糖苷酶，调节pH值，改变细胞通透性，促使大量皂苷转化为稀有皂苷。

主权项：1.一种基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、预处理：选取新鲜的桦褐孔菌子实体，去除表面杂质，依次用清水、酒精冲洗；S2、桦褐孔菌的分离纯化、诱变和筛选，包括如下步骤：Sa1、分离纯化：无菌条件下，切取桦褐孔菌子实体的菌核组织块接入分离培养基进行分离培养，分离培养后挑选菌落边缘转移至PDA加富培养基进行纯化培养，纯化培养后再挑选菌丝生长粗壮旺盛的菌丝体接种于PDA斜面培养基进行避光培养，得到菌种菌丝体；所述分离培养基为添加桦树皮粉末10～15gL、琼脂15～18gL、其余为水的固体培养基；所述PDA斜面培养基为添加马铃薯8～12gL、葡萄糖10～15gL、魔芋粉4～8gL、其余为水的固体培养基；所述PDA加富培养基为在PDA斜面培养基中添加3～4gL魔芋粉的固体培养基；Sa2、诱变：将步骤Sa1纯化后的菌落转接至PDA液体培养基中摇床培养后摇碎菌丝，再经过灭菌脱脂棉过滤，得到菌丝悬液；将经生理盐水稀释的菌丝悬液涂抹在装有15～20mLPDA培养基的平板上进行光照培养；所述PDA液体培养基为添加马铃薯8～12gL、葡萄糖10～15gL、其余为水的液体培养基；所述PDA培养基为添加马铃薯8～12gL、葡萄糖10～15gL、魔芋粉4～8gL、其余为水的固体培养基；Sa3、筛选：光照培养后，黑暗条件下对平板进行恒温培养，恒温培养后挑选菌丝发育良好的菌株接种于PDA液体培养基进行摇床培养，培养后再利用10倍稀释法逐级稀释菌液，将稀释后的菌液在筛选培养基上涂布均匀，密封后再进行倒置培养，倒置培养后挑选菌落周围呈红棕色且边缘整齐的单一菌落接种到新的筛选培养基进行倒置培养，重复3～6次密封后的步骤，得到单一菌株桦褐孔菌Y104；将平板上的菌丝转移至PDA液体培养基进行摇床培养，获得桦褐孔菌Y104的菌液培养液，培养条件为温度25～28℃，时间为7～10d，摇床培养的转速为100～120rmin；所述筛选培养基为添加14～16gLR2A合成培养基、柠檬酸铁0.3～0.6gL、七叶苷0.8～1.2gL，其余为水的固体培养基；S3、人参不定根的诱导与增殖：取人参的根部脱毒后切成小段接种至诱导培养基进行诱导培养，将诱导培养得到的人参不定根接种至固体增殖培养基进行继代培养后再转接至液体增殖培养基进行增殖培养，得到液体增殖培养体系；所述诱导培养基为添加1～2mgLIBA、0.5～0.8mgLNAA、0.5％琼脂和3％蔗糖的MS培养基；所述液体增殖培养基为添加4～6mgLIBA、0.3～0.6mgLNAA、3％蔗糖的MS培养基；所述固体增殖培养基为液体增殖培养基中添加0.5％琼脂；S4、人参不定根的生物反应器培养：将步骤S4所述液体增殖培养体系转移至生物反应器中进行培养，得到人参不定根；S5、Gly-Ge培养基培养：将步骤S5得到的人参不定根转接至Gly-Ge培养基中，并再次置于生物反应器进行第一阶段培养，第一阶段培养后，向生物反应器中加入步骤Sa3得到的菌液培养液进行第二阶段培养，得到高含量稀有皂苷的人参不定根；所述Gly-Ge培养基为在去除Gly的MS母液培养基中加入0.1～0.3mgLGly-Ge反应液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 大连工业大学 一种基于高含量人参皂苷提高稀有皂苷转化率的方法

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