申请/专利权人：南京工业大学

申请日：2023-12-21

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN117844842A

主分类号：C12N15/81

分类号：C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12N15/12;G01N21/64;C12R1/865

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.26#实质审查的生效;2024.04.09#公开

摘要：铜是生命的必需元素，是某些活性蛋白的辅基。但是，过量的铜具有一定毒性，既对环境有害而威胁环境安全，又会通过食物链富集而损害人类健康。因此，建立灵敏、快速和可靠的铜离子生物检测方法尤为重要。本发明提出一种酿酒酵母铜离子生物传感器的信号级联反应机制模型。该酿酒酵母铜离子生物传感器，先通过响应Cu2+的启动子pCUP1控制信息素的表达，再由信息素激发MAPK信号联级，以启动下游的基因转录而产生GFP表达，从而灵敏、特异性定量检测Cu2+。对信号级联反应机制建模，并结合实验数据筛选和匹配能够增强GFP水平的模型参数，从而提高传感器灵敏度，达到更好的Cu2+检测效果。

主权项：1.一种酿酒酵母铜离子生物传感器的信号级联反应机制模型，其特征是所述生物传感器的检测过程包括；首先，铜离子诱导型的CUP1基因启动子pCUP1作为传感器的探测器识别出细胞质中的铜离子，并引导α-交配因子α-factor基因转录及翻译成信息素蛋白；该信息素蛋白作为信号转换器的输入信号；所述α-交配因子是酿酒酵母的分泌信号；接着，信号转换器中G蛋白受体与游离的信息素结合而触发异三聚体G蛋白Gαβγ的解离；释放的Gβγ二聚体招募支架蛋白Ste5，Ste11、Ste7和Fus3以激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联的信号传导和放大；所述Ste11是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK，Ste7是丝裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK，Fus3是丝裂原活化蛋白激酶MAPK；信号通路是Ste11→Ste7→Fus3；最后，磷酸化的Fus3进入细胞核后诱发抑制剂Dig1和Dig2的磷酸化，使它们与转录因子Ste12分离以促进信息素诱导型基因的转录产生绿色荧光；根据酿酒酵母铜离子生物传感器的检测原理，对信号级联反应机制建模：1铜离子代谢模型设底物铜离子浓度为x、转录过程中生成的信息素mRNA浓度为s1、翻译过程中生成的信息素浓度为s2；铜离子代谢过程满足Michaelis-Menten条件，则，采用如下微分方程组描述pCUP1驱动α-factor基因表达生成信息素的过程 其中，γ1和β1分别是α-factor基因的基础表达水平和最大转录速率，Kx是铜离子结合常数，μ1和τ1分别是信息素mRNA的降解速率和翻译速率，μ2是信息素的降解速率；2MAPK信号通路模型首先，铜离子代谢过程中生成的信息素结合G蛋白偶联受体GPCR后，触发异三聚体G蛋白Gαβγ的解离，而释放的Gβγ二聚体通过中间体Ste5激活下游的MAPK级联；接着，Ste12通过pprm1结合到信息素应答元件PREs上，激活下游的绿色荧光蛋白GFP基因转录；由于Ste12作为网络的中间节点，则按照两个阶段对酵母细胞响应信息素过程建模：阶段1：上游的MAPK级联因为Ste12被Fus3磷酸化的速率vSte12与激酶Fus3的反应速率活化的Fus3浓度[Fus3]和Ste12未被Fus3磷酸化的浓度[Ste120]密切相关，所以由一级反应动力学得到 此外，Ste12被Fus3磷酸化的浓度[Ste12p]的变化率满足动力学方程 其中λ表示Ste12p去磷酸化的速率；将式3代入式4得到 级联过程的稳态条件是 令Ste12的总浓度为[Ste12T]，根据数量守恒定律[Ste12p]+[Ste120]＝[Ste12T]7计算式6得到 于是，Ste12被Fus3磷酸化的比例为 因为Ste12被Fus3磷酸化过程处于黑箱中，则讨论输入变量[Fus3]对动力学模型的影响：定义中间变量和递增的饱和函数来简化式9 其中式10给出了Ste12被Fus3一次磷酸化的表达式，该表达形式也用于描述MAPK信号通路中Ste11、Ste7被Fus3磷酸化的过程，即 由于G蛋白被激活后会招募激酶Ste11，而激活的G蛋白浓度G*与是一一对应关系，于是，式11中磷酸化过程用G*替换且表示为 根据Hill函数，有 变形式13得到G*的表达式 其中GT为G蛋白的总浓度，K2是信息素的米氏常数；阶段2：下游的GFP表达假设GFP表达强度为y及GFP的mRAN浓度为s3，使用一组Michaelis-Menten方程对GFP基因表达过程建模 其中γ2和β2分别表示GFP的mRNA的基础转录速率和最大表达水平，μ3和βy分别表示GFP的mRNA的降解速率和翻译速率，μy表示GFP的降解速率；3铜离子检测的传递函数铜离子进入酿酒酵母细胞参与代谢引起细胞内代谢通路的变化，这种变化表现为信号分子的释放、信号通路蛋白的磷酸化和转录因子的激活；不断进行反应使铜离子的感应和响应达到稳定状态，即满足如下方程组 结合式1和式2求解方程17a和17b可获得信息素浓度和铜离子浓度的关系式 其中K2＝τ1μ2表示信息素的米氏常数，Kbase＝γ1μ1表示信息素的基础表达水平，K1＝β1μ1表示信息素mRNA的米氏常数；于是，式14又转变为 接着，结合式15和式19求解方程17c得到信息素浓度和荧光蛋白表达水平的关系式 其中Kleak＝γ2μ3表示荧光蛋白mRAN的基础表达水平，Kmapk＝β2μ3表示MAPK通路中荧光蛋白的最大表达水平；最后，由式16求解方程17d得到铜离子诱导荧光表达的传递函数 其中Ky＝βyμy表示荧光蛋白的解离常数；再将式20代入式21得到一个完整的传递函数 由此，定义铜离子检测的传递函数y＝Φx及其反函数x＝Φ-1y；在线检测时，将流式细胞仪检测的GFP强度代入反函数得到铜离子浓度的估计值。

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百度查询： 南京工业大学 酿酒酵母铜离子生物传感器的信号级联反应机制模型

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