申请/专利权人：江苏金斯瑞生物科技有限公司

申请日：2019-12-27

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN113227370B

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10

优先权：["20181228 CN 2018116241650"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2022.01.14#实质审查的生效;2021.08.06#公开

摘要：提供了一种单链DNA合成方法，具体为一种无碱基突变的单链DNA的制备工艺，通过尿嘧啶特异性减除酶USER介导的双链DNA自动成环结合滚环复制来制备单链DNA。

主权项：1.一种制备目标单链DNA的方法，其包括：1获得由第一链和与之反向互补的第二链组成的模板双链DNA分子，其中第一链的序列结构如式I所示：5’左适配序列-目标单链DNA序列-右适配序列3’I其中，左适配序列的序列结构如下式所示：XnTXqXA；右适配序列的序列结构如下式所示：XBXq’Xn-m，式中，Xn为一段由n个核苷酸组成的核苷酸序列，其中5’核苷酸为A；n为至少4的任一整数；Xq为一种II型限制性内切酶的识别位点序列，且Xq在目标单链DNA序列中不存在；Xq’为Xq的反向互补序列；XA、XB分别为0个至数个核苷酸，使得XqXA、XBXq’分别构成该II型限制性内切酶的切割位点，允许该II型限制性内切酶在XqXA序列的3’端及XBXq’序列的5’端切割；Xn-m为Xn的自5’起n-m个核苷酸的序列，m为1-3的整数；A表示腺嘌呤核苷酸；T表示胸腺嘧啶核苷酸；2以模板双链DNA分子为模板，用正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到产物DNA双链分子，其包含含有目标单链DNA序列的第一链以及与其反向互补的第二链；其中所述正向引物包含XnUXqXA的序列，所述反向引物包含Xn-m’XqXB’的序列，其中，Xn、Xq、XA、XB与1中的相同；Xn-m’为所述Xn-m的反向互补序列，但其中3’端的T用U代替；XB’为所述XB的反向互补序列；U为尿嘧啶核苷酸；3用尿嘧啶特异性切除试剂在产物DNA双链分子两条链中所含的U处分别切断，以在产物DNA双链分子的两个末端产生粘性末端；4在连接酶存在下，令产物DNA双链分子的两个粘性末端相互连接，从而形成环状双链DNA，其中第一链含有缺口；5对步骤4得到的含缺口的环状双链DNA进行滚环复制，其中复制以产物DNA双链分子正义第一链的缺口为起始点，以其第二链作为模板，从而获得包含多个串联的下述式II所示序列结构的复制子：5’-XnTXqXA-目标单链DNA序列-XBXq’-3’；II6对复制子进行退火，使得复制子中相邻的两个目标单链DNA序列之间形成发卡结构；7用所述II型限制性内切酶处理复制子，在相邻的目标单链DNA序列之间的XBXq’XnTXqXA序列的5’端和3’端分别切割，从而释放出多个目标单链DNA序列。

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百度查询： 江苏金斯瑞生物科技有限公司 一种单链DNA合成方法

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