申请/专利权人：连云港冠昕医药科技有限公司;连云港博凯莱特生物科技有限公司

申请日：2023-05-30

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821547A

主分类号：C12P19/38

分类号：C12P19/38;C12N15/54;C12N15/70

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明涉及一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，属于生物催化反应技术领域，包括步骤S1：载体构建与克隆；取磷酸化酶PNP核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶‑pET28aSEQIDNO.1‑pET28a；步骤S2：培养取种；步骤S3：验证；步骤S4：酶的表达和提取；步骤S5：纯化；步骤S6：反应；步骤S7：测量。解决了化学方法合成烟酰胺核糖分为好几个步骤，会产生很多中间体，存在中间体分离困难的问题，导致产率不高，生产效率低下的技术问题，主要应用于生物催化合成烟酰胺核糖方面。

主权项：1.一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：载体构建与克隆；取磷酸化酶PNP核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28aSEQIDNO.1-pET28a；步骤S2：培养取种；对步骤S1连接载体进行培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；步骤S3：验证；将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株；步骤S4：酶的表达和提取；将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至0.9-1.1后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000gmin离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mMPBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000gmin离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；步骤S5：纯化；使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；步骤S6：反应；在玻璃反应瓶中，先加入底物腺苷肌苷、尼克酰胺，而后加入MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入PBS溶液缓冲液，反应5-7h，反应液温度为30-40℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。步骤S7：测量；步骤S6反应前，测量底物腺苷肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。

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