申请/专利权人：北华大学

申请日：2023-12-08

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821620A

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/01

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.04.05#公开

摘要：本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术在细菌耐药基因检测中的应用，是一种联合分子生物学技术和免疫学技术快速鉴定鲍曼不动杆菌碳青霉烯类OXA和喹诺酮类parC抗生素耐药性的检测方法。其特点是，双重PCR反应体系20μL：2×MultiplexPCRMasterMix10μL，DNA1μL，引物混合物2μL，余为ddH2O。本发明是基于Ab的OXA和parC基因片段具有高度保守性，使用PrimerPremier5.0设计特异性引物，用基因扩增仪进行PCR扩增，得到的产物一端修饰的生物素首先与金标垫上含有链霉亲和素的胶体金结合，再与胶体金试纸条上的二抗、生物素结合呈现红色线从而建立的双重核酸胶体金试纸条。依据该技术所研制的试剂盒，具有节省时间、提高效率等特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

主权项：1.基于核酸胶体金试纸条快速检测鲍曼不动杆菌的OXA、parC耐药基因的方法，其特征包含：1特异性引物基于NCBI数据库中已发表的鲍曼不动杆菌的OXA、parC序列，进行多重序列比对，根据比对结果，采用PrimerPremier5.0分别设计特异性引物：OXA355bp正向引物：5'6-FAMTGGAAGGGCGAGAAAAGGTC3'反向引物：5'BiotinTTGCCCAACCAGTCTTTCCA3'parC230bp正向引物：5'DigCGCGTACAGTGGGTGATGTA3'反向引物：5'BiotinAGTGCCCTGACCTAATTCGC3'2阳性对照品将电泳后的目的条带进行琼脂糖凝胶DNA回收、纯化，再与pGM-T载体连接后转入DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆白色菌落在含3μLAmp的LB液体培养基进行过夜摇菌，提取质粒DNA，以此为模板进行扩增，PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒作为试剂盒的阳性对照品。3鉴定反应体系双重PCR反应体系20μL：2×MultiplexPCRMasterMix10μL，DNA模板10ng·μL-11μL，2对引物混合物每个引物终浓度为10ng·μL-12μL，余为双蒸馏水。胶体金试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加30μL，检测线T1兔抗6-FAM多克隆抗体0.55mgmL；检测线T2兔抗Digoxin多克隆抗体0.4mgmL进行划线；质控线C线生物素化的牛血清白蛋白1mgmL进行划线，样品稀释液100μL，取上述待检PCR产物10μL。4阳性对照反应体系双重PCR反应体系20μL：2×MultiplexPCRMasterMix10μL，质粒DNA10ng·μL-11μL，2对引物混合物每个引物终浓度为10ng·μL-12μL，余为双蒸馏水。胶体金试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加30μL，检测线T1兔抗6-FAM多克隆抗体0.55mgmL；检测线T2兔抗Digoxin多克隆抗体0.4mgmL进行划线；质控线C线生物素化的牛血清白蛋白1mgmL进行划线，样品稀释液100μL，取上述待检PCR产物10μL。5阴性对照反应体系双重PCR反应体系20μL：2×MultiplexPCRMasterMix10μL，大肠埃希菌DNA10ng·μL-11μL，2对引物混合物每个引物终浓度为10ng·μL-12μL，余为双蒸馏水。胶体金试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加30μL，检测线T1兔抗6-FAM多克隆抗体0.55mgmL；检测线T2兔抗Digoxin多克隆抗体0.4mgmL进行划线；质控线C线生物素化的牛血清白蛋白1mgmL进行划线，样品稀释液100μL，取上述待检PCR产物10μL。6反应条件双重PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共计30个循环；72℃再延伸7min。取PCR产物10μL于EP管中加入100μL样品稀释液混匀后，取50μL稀释产物滴加在胶体金试纸条点样处，5min后观察结果。

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