申请/专利权人：珠海中信大有科技有限公司

申请日：2023-12-22

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821385A

主分类号：C12N5/0783

分类号：C12N5/0783

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明涉及一种步骤简单，操作方便的NK细胞膜的提取方法，提取得到的NK细胞膜的稳定性好、包封率高。本发明方法包括以下步骤：a.NK细胞的提取；b.NK细胞膜提取；c.用BCA法测定提取细胞膜中的蛋白浓度，为1.36mgmL。本发明应用于生物技术领域。

主权项：1.一种NK细胞膜的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：a.NK细胞的提取：从浸泡于75%的乙醇中的小鼠中取出小鼠脾脏后，置于35mm培养皿中，加入5mL小鼠淋巴细胞分离液，充分研磨后，用0.22微米筛网过滤；将悬有脾脏细胞的分离液迅速转移到15mL离心管中，并加入1mL的RPMI1640培养基，保持液面分界明显；在室温条件下水平转子800g离心30min；吸出淋巴细胞层，再加入10mLRPMI1640培养基，颠倒洗涤，室温条件下250g离心10min收集细胞；倾倒上清液，用培养液重悬细胞，细胞计数；300g离心细胞10min，倒去上清液；加入适量缓冲液重悬细胞，加入适量NK细胞生物素化抗体工作液；混匀细胞，4℃孵育细胞5min；适量缓冲液清洗细胞，300g离心10min，倾去上清液；加入适量缓冲液，加入生物素化抗体磁珠，混匀细胞，4℃孵育10min；使用商品化分选柱分选NK细胞；b.NK细胞膜提取：离心分离出提取的NK细胞，加入预冷的含有蛋白酶抑制剂cooktail的Tris镁缓冲液重悬细胞，冰浴30min，用无聚碳酸酯膜的脂质体挤出器挤压破坏细胞，向细胞悬液中加入适量蔗糖溶液，蔗糖终浓度为0.25M，将该溶液充分混匀后于4℃，2000g离心10min，去除细胞内成分，收集上清液，将沉淀物用Tris镁缓冲液重悬并重复上述步骤3次，将最终收集的上清液于4℃，15000g离心30min，收集沉淀物，用PBS重悬后于超声清洗机上超声30s，随后用装有400nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器挤压20次，即获得提取好的NK细胞膜，-20℃保存；c.用BCA法测定提取细胞膜中的蛋白浓度，为1.36mgmL。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 珠海中信大有科技有限公司 一种NK细胞膜的提取方法

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