申请/专利权人：韩国科学技术院

申请日：2018-02-26

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN110382699B

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P7/625;C08G63/688;C12R1/19

优先权：["20170228 KR 10-2017-0026266","20171215 KR 10-2017-0172899"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2019.11.19#实质审查的生效;2019.10.25#公开

摘要：本发明涉及重组微生物，所述重组微生物导入有编码2‑羟基异己酸‑CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸合酶的基因并且具有生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的聚羟基链烷酸酯的潜力，并且涉及使用所述重组微生物生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。根据本发明，可以生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的可生物降解的聚合物。

主权项：1.一种大肠杆菌E.coli的重组微生物，在该重组微生物中编码具有SEQNOID:1的氨基酸序列的2-羟基异己酸-CoA转移酶HadA的基因、编码聚羟基链烷酸PHA合酶的突变体酶的基因、编码具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP合酶的基因、编码具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因和编码具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的D-乳酸脱氢酶的基因被导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中，在所述PHA的突变体酶中在SEQIDNO:2的氨基酸序列中E130D、S325T、S477G和Q481K发生突变，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯，并且其中所述芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸。

全文数据：使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法【技术领域】本发明涉及生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。更具体地，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物导入了编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因并且能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯，并且涉及使用所述重组微生物生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。【背景技术】聚羟基链烷酸酯PHA是由各种微生物合成的生物聚酯。这些聚合物是可生物降解的和生物相容的热塑性材料，可用于各种工业生物医学应用因为其性质类似于石油基聚合物，并且由可再生资源生成Lee,S.Y.Biotechnol.Bioeng.49:11996。PHA分为具有短碳数的短链长度PHA和具有长碳数的中链长度PHA，其取决于侧链的长度。通过重组微生物合成了各种PHA，所述重组微生物通过克隆来源于微生物例如真养雷氏菌Ralstoniaeutropha，假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌属Bacillus的PHA合成基因生成Qi等人.,FEMSMicrobiol.Lett.,157:155,1997；Qi等人.,FEMSMicrobiol.Lett.,167:89,1998；Langenbach等人.,FEMSMicrobiol.Lett.,150:303,1997；WO0155436；US6,143,952；WO9854329；WO9961624。具有短侧链的PHA例如PHB，其是R-3-羟基丁酸的同聚物是晶体的热塑性材料，并且由于其低弹性而容易断裂。另一方面，具有长侧链的MCL-PHA具有更高的弹性。PHB大约在70年前首次被人们所知Lemoigne&Roukhelman,1925。另一方面，MCL-PHA相对近期被人们所知deSmet等人.,J.Bacteriol.154:870-781983。这些共聚物可以由聚3HB-共-3-HX表示，其中X代表3-羟基链烷酸酯，或具有6个或更多个碳原子的链烷酸酯或链烯酸酯。两种特定单体的共聚物的特定实例是聚3HB-共-3-羟基己酸酯Brandl等人.,Int.J.Biol.Macromol.11:49,1989；Amos&McInerney,Arch.Microbiol.,155:103,1991；US5,292,860。PHA的生物合成包括通过CoA-转移酶或CoA-连接酶将羟基酸转化为羟基酰基-CoA，并使用PHA合酶使转化的羟基酰基-CoA聚合。在天然PHA合酶的情况下，2-羟基酰基-CoA的活性远低于3-羟基酰基-CoA的活性。然而，最近，本发明人开发了基因工程改造的假单胞菌属物种Pseudomonassp.6-19的PHA合酶PhaC1ps6-19以使用乳酰-CoA一种2-羟基酰基-CoA作为底物WO08062996；Yang等人.,Biotechnol.Bioeng.,105:150,2010；Jung等人.,Biotechnol.Bioeng.,105:161,2010。PhaC1ps6-19具有广泛的底物特异性，并且可以使用乳酰-CoA一种2-羟基酰基-CoA作为底物。因此，通过开发将各种2-羟基酸转化为2-羟基酰基-CoA的体系，将使合成含有不同类型的2-羟基酸的新PHA成为可能。因此，本发明人已经进行了深入的努力以开发用于生物合成含有2-羟基酸的PHA的新方法。作为结果，本发明人发现，当使用乙酰-CoA筛选将2-羟基酸转化为2-羟基酰基-CoA的酶并使用所述酶时，可以在体外条件下生成各种种类的2-羟基酰基-CoA，并且使用其来生成各种PHA。基于此发现，完成本发明。【发明内容】【技术问题】因此，本发明的一个目的是提供重组微生物，其能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。本发明的另一个目的是提供使用所述重组微生物生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。【技术方案】根据本发明的一个方面，提供了重组微生物，其通过将编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。根据本发明的另一方面，提供生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括a培养所述重组微生物以生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。根据本发明的另一方面，提供了重组微生物，其通过在能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中扩增以下基因获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、和编码D-乳酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。根据本发明的另一方面，提供生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养所述重组微生物以生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。根据本发明的另一方面，提供了重组微生物，其通过在能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中扩增以下基因获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、编码D-乳酸脱氢酶的基因、编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因、和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。根据本发明的另一个方面，提供生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养所述重组微生物以生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。【附图说明】现在将详细参考本发明的优选实施方案，其实施例在附图中阐明。只要有可能，在整个附图中将使用相同的附图标记来指代相同或相似的部分。图1显示根据本发明的芳香族聚酯的生物合成代谢途径，其中图1A显示当使用FldA肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶时的代谢途径，以及图1B显示当使用HadA2-羟基异己酸-CoA转移酶时的代谢途径；图2显示HadA和FldA之间氨基酸序列同源性的比较结果；图3A显示使用His标签纯化HadA的结果，以及图3B显示了关于HadA是否能够使用乙酰-CoA作为CoA供体的鉴定结果；图4显示体外测定的结果，之后通过LC-MS分析鉴定HadA是否能够使用乙酰-CoA作为CoA供体将以下物质转化为相应的CoA衍生物：扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸；图5显示了可以使用HadA执行的各种底物的CoA转化反应的分子式；图6显示了根据为了增加D-苯基乳酸酯生成的计算机模拟in-silico基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析结果；图7显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的分析结果；图8显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-3-羟基-3-苯基丙酸酯和聚3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-D-扁桃酸酯的分析结果；图9显示了大肠杆菌XB201TBAL菌株中聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的生成的结果，所述菌株在具有不同强度的五种启动子下表达PhaAB；和图10A和图10B显示，通过对MR培养基含有3HB中大肠杆菌XB201TBAL菌株表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaC1437进行补料分批发酵生成聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的结果，图10C和图10D显示通过对大肠杆菌XB201TBAL菌株在启动子BBa_J23114控制下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB进行补料分批发酵不添加3HB生成聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的结果，图10E和10F显示了通过对大肠杆菌XB201TBAF菌株在启动子PhaC1437下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaAB进行补料分批发酵不外部添加3HB生成聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的结果。【具体实施方式】除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。通常，本文所用的命名法在本领域中为公知的并且为通常使用的。芳香族聚酯是必不可少的塑料，其主要由石油生成。本发明建立了一种通过代谢工程改造的大肠杆菌表达对芳香族单体有活性的聚羟基链烷酸酯PHA合酶和辅酶ACoA转移酶从葡萄糖一步生成具有芳香族聚酯或长链2-羟基链烷酸酯作为单体的聚合物的方法。在本发明的一个实施方案中，为了生成含有苯基乳酸酯的PHA作为芳香族聚酯，将肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶FldA和4-香豆酸酯:CoA连接酶4CL通过体外分析发现具有活性与PHA合酶在生成D-苯基乳酸酯的大肠杆菌菌株中一起表达。使用体内生成的肉桂酰-CoA作为CoA供体，所述菌株制备出聚16.8mol％D-乳酸酯-共-80.8mol％3HB-共-1.6mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-4-羟基苯基乳酸酯聚合物，其量为干细胞重量的12.8wt％。然而，由于苯基乳酸酯CoA-转移酶FldA的芳香族底物的利用范围非常窄，因此鉴定、选择并使用2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA-转移酶HadA用于芳香族PHA的生成，HadA可使用乙酰-CoA作为CoA供体生成各种种类的芳香族羟基酰基CoA。为了大量生成含有高摩尔分数的D-苯基乳酸酯的芳香族PHA，首先设计最佳代谢途径以过量生成D-苯基乳酸酯单体。在本发明的一个实施方案中，为了生成具有最适合生成D-苯基乳酸酯的代谢途径的代谢工程改造的大肠杆菌，根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析，在tyrR缺陷的大肠杆菌中过表达抗反馈的aroG、pheA和fldH基因，缺失竞争性代谢途径pflB、poxB、adhE和frdB，并且进一步缺失tyrB和aspC基因。所述代谢工程改造的大肠杆菌生成1.62gL的D-苯基乳酸酯。当HadA和PHA合酶在过量生成D-苯基乳酸酯的菌株中表达时，生成聚52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的15.8wt％。并且，通过生成包含4-羟基苯基乳酸酯、扁桃酸酯和3-羟基-3-苯基丙酸酯的聚酯，证实了制备各种芳香族聚酯的潜力。因此，一方面，本发明涉及重组微生物，其通过将编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸合酶的基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。在本发明中，长链2-HA表示具有6至8个碳原子的2-羟基链烷酸酯。在本发明中，芳香族单体或长链2-HA单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯、4-羟基苯甲酸和扁桃酸酯。在本发明中，所述聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌Ralstoniaeutropha、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属物种Pseudomonassp.6-19，或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是来源于艰难梭菌630Clostridiumdifficile630的hadA。在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以使用乙酰-CoA作为CoA供体。可以进一步将编码参与3-羟基丁酰-CoA生物合成的β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因导入本发明的微生物，以使所述微生物即使在无外部提供3HB的情况下也能生成聚合物。另一方面，本发明涉及生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养所述重组微生物以生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。在本发明的一个实施方案中，证实了用于合成聚羟基链烷酸酯的Pct丙酰-CoA转移酶是否能够分别用苯基乳酰-CoA和M扁桃酰-CoA活化苯基乳酸酯和扁桃酸酯。所述Pctcp突变体Pct540已成功应用于聚酯的体内生成，所述聚酯包括各种羟基酸，例如乙醇酸、乳酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸和2-羟基酸。因此，可以认为Pct540对于碳的数目和羟基位置具有宽的底物谱。然而，已经证实Pct540针对苯基乳酸酯和扁桃酸酯没有催化活性。因此，在本发明中，试图找到能够活化对应于芳香族化合物的CoA衍生物以生成芳香族共聚物的新型CoA-转移酶。据报道，生孢梭菌Clostridiumsporogenes的肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶FldA能够使用肉桂酰-CoA作为CoA供体将苯基乳酸酯转化为苯基乳酰-CoADickert,S.等人.,Eur.J.Biochem.267:3874,2000。由于肉桂酰-CoA是大肠杆菌的非天然代谢产物，所以对衍生自肉毒梭菌ClostridiumbotulinumA菌株ATCC3502的FldA与生孢梭菌C.sporogenes的FldA具有99.0％的同源性进行检测以确认乙酰-CoA细胞中富含的代谢物是否用作辅酶A供体。然而，发现肉毒杆菌A菌株ATCC3502的FldA没有使用乙酰-CoA作为CoA供体来生成苯基乳酰-CoA的催化活性。同时，已知天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor4-香豆酸酯:CoA连接酶4CL在苯丙素类代谢中起关键作用，所述代谢生成植物次生代谢产物的前体，如木质素、黄酮类和植物抗毒素Kaneko,M.等人.,J.Bacteriol.,185:20,2003。因此，在本发明的一个实施方案中，通过导入4CL设计用于从肉桂酸酯合成肉桂酰-CoA的生物合成途径。使用4CL突变体将肉桂酸酯转化为肉桂酰-CoA，并使用肉桂酰-CoA作为FldA的CoA供体以形成苯基乳酰-CoA。结果，通过4CL和FldA的连续体外反应成功合成了苯基乳酰-CoA。这些结果表明4CL和FldA可用于生成苯基乳酰-CoA和生成芳香族聚酯。类似地，可以证实通过4CL变体与FldA的连续体外反应，另一有希望的芳香族单体4-羟基苯基乳酸酯也转化为4-羟基苯基乳酰-CoA。在非天然聚酯的生成中，重要的是针对相应的CoA底物的聚合选择PHA合酶的突变体。因此，为了研究各种PHA合酶的性能，假单胞菌属物种MBEL6-19PHA合酶PhaCPs6-19突变体在过表达AroGfbr、PAL、4CL、FldA和Pct540的大肠杆菌XL1-Blue中进行表达。将所述制备的重组菌株在补充有20gL葡萄糖、1gLD-苯基乳酸酯和1gL3-羟基丁酸3HB钠的MR培养基中培养。3-羟基丁酸3HB钠通过Pct540转化为3HB-CoAPhaC的优选的底物，并且将其加入以增强聚合物的生成，因为它允许生成足够量的PHA。表达其他PHA合酶突变体的大肠杆菌XL1-Blue可生成各种量的具有不同单体组成的聚D-乳酸-共-3HB-共-D-苯基乳酸酯。作为上述实验的结果，在PhaC突变体中，具有四个氨基酸取代的PhaC1437E130D、S325T、S477G和Q481K生成聚18.3mol％D-乳酸酯-共-76.9mol％3HB-共-4.8mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的7.8％，这意味着PhaC1437是最合适的PhaC突变体。接下来，在体内对大肠杆菌进行工程改造以从葡萄糖生成D-苯基乳酸酯。芳香族化合物的生物合成始于3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP的合成，其通过用DAHP合酶在磷酸烯醇丙酮酸PEP和赤藓糖-4-磷酸E4P之间进行缩合生成。将生成的DAHP转化为苯丙酮酸酯PPA，然后通过D-乳酸脱氢酶FldH将苯丙酮酸酯转化为D-苯基乳酸酯图1。已知芳香族化合物生物合成的代谢途径由各种抑制的机制以复杂的方式控制。由aroG编码的DAHP合酶和由pheA编码的分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的表达被L-苯丙氨酸抑制Ribe,D.E.等人.,J.Bacteriol.127:1085,1976。在本发明中，构建抗反馈抑制的突变体AroGfbr[AroGD146N]和PheAfbr[PheAT326P]，以释放L-苯丙氨酸的反馈抑制Zhou,H.Y.等人.,Bioresour.Technol.101:4151,2010；Kikuchi,Y.等人.,Appl.Environ.Microbiol.63:761,1997。表达肉毒杆菌A菌株ATCC3502的AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue从15.2gL葡萄糖生成0.372gL的D-苯基乳酸酯。所述菌株的PAL、4CL、FldA、Pct540和PhaC1437的过表达使聚16.8mol％D-乳酸酯-共-80.8mol％3HB-共-1.6mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-4-羟基苯基乳酸酯增加至干细胞重量的12.8wt％。生成含有D-苯基乳酸酯的芳香族PHA方面存在两个问题。所述第一个问题是聚合物合成的效率和芳香族单体的含量非常低。这被认为是由于使用肉桂酰-CoA作为CoA供体的情况下FldA的低效率。所述第二个问题是芳香族PHA的单体谱非常窄。体外酶分析结果表明，FldA可以将CoA转移到苯基乳酸酯和4-羟基苯基乳酸酯，但不能将其转移到以下底物例如：扁桃酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸。为了解决这些问题，本发明使用乙酰-CoA作为CoA供体以找到具有广芳香族底物谱的酶。进行序列相似性分析以鉴定FldA的同源酶，并且筛选出艰难梭菌的2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA-转移酶HadA，其与FldA在具有不同的来源的各种FldA中具有48％或更高氨基酸序列同一性图2。在本发明中，已经研究了HadA是否可以使用乙酰-CoA作为CoA供体，因为HadA是已知使用异己烯酰基-CoA作为CoA供体将CoA转化进入2-羟基异己酸酯的酶图3。有趣的是，体外酶分析的结果显示，使用乙酰-CoA作为CoA供体的情况下，HadA可以将苯基乳酸酯活化成苯基乳酰-CoA图4。此外，体外分析后的LC-MS分析表明，HadA可以将以下化合物转化相应的CoA衍生物：扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸图4和图5。因此，使用乙酰-CoA作为CoA供体的情况下，HadA具有更有效地生成各种芳香族聚酯的潜力。接下来，为了通过代谢工程增加芳香族单体的产量，通过对表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue菌株从葡萄糖生成少量0.372gLD-苯基乳酸酯进行代谢工程改造，所述得率有所提高。构建了表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XBT菌株，其缺失TyrR一种双重转录调控因子，可以进行调节以抑制芳香族氨基酸的生物合成，所述大肠杆菌XBT菌株从16.4gL的葡萄糖生成0.5gL的D-苯基乳酸酯，因此显示出比没有缺失TyrR的大肠杆菌XL1-Blue菌株高30％的生产力。为了去除与D-苯基乳酸酯生物合成竞争的途径，通过从大肠杆菌XBT缺失poxB编码丙酮酸氧化酶的基因、pflB编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、adhE编码乙醛脱氢酶乙醇脱氢酶的基因和frdB编码富马酸还原酶的基因来构建大肠杆菌XB201T。表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌菌株XB201T从15.7gL葡萄糖生成0.55gL的D-苯基乳酸酯，其显示出比大肠杆菌XBT的高10％的得率。此外，进行根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析以进一步增加D-苯基乳酸酯的生成图6。从大肠杆菌菌株XB201T中去除编码酪氨酸氨基转移酶的tyrB基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，以减少L-苯丙氨酸的生物合成并从而增强碳向D-苯基乳酸酯的流动。结果，表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌菌株XB201TBA从18.5gL葡萄糖生成1.62gL的D-苯基乳酸酯，导致得率大幅增加，这相当于大肠杆菌XL1blue菌株生成的D-苯基乳酸酯的4.35倍。当在含有20gL葡萄糖和1gL3HB钠的培养基中培养大肠杆菌XB201TBAL表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA时，生成聚52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的15.8wt％图7。另一方面，本发明涉及重组微生物，其通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物而获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因，编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、和编码D-乳酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是衍生自艰难梭菌630的HadA，并且聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种6-19；或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。在本发明中，编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因是编码SEQIDNO:8所示氨基酸序列的基因，编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因可以是编码SEQIDNO:9所示氨基酸序列的基因，编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是编码SEQIDNO:10所示氨基酸序列的基因。在本发明中，所述导入的编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是替代ldhA基因的fldH基因。本发明的微生物可以进一步导入参与3-羟基丁酰基-CoA生物合成的编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因，以使所述微生物即使在无外部补充3HB钠的情况下也能生成聚合物。当在本发明中导入的编码β-酮硫解酶的基因phaA和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因phaB的表达量通过启动子的强度密度来调节时，可以控制PHA中含有的D-苯基乳酸酯单体的摩尔分数。在本发明的一个实施方案中，构建五种不同的质粒以具有不同强度的五种类型的启动子表达phaA和phaB，并将其导入到表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株中。证实，随着phaA和phaB表达降低，所述苯基乳酸酯单体的摩尔分数增加图9A和图9B和表7。这些结果表明，通过控制代谢通量可以生成具有各种摩尔分数的芳香族单体的芳香族聚酯。在本发明中，所述重组微生物具有选自以下的至少一种基因的缺失：tyrR基因、编码丙酮酸氧化酶的基因、编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、编码乙醛脱氢酶的基因、编码富马酸还原酶的基因、编码酪氨酸氨基转移酶的基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的基因。另一方面，本发明涉及制备具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养所述重组微生物以生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。为了鉴定上述方法是否可用于制备各种芳香族聚合物，使用扁桃酸酯作为单体进行实验。其原因在于，聚扁桃酸酯扁桃酸酯的同聚物是具有100℃的相对高Tg的耐热解聚合物，并且具有与聚苯乙烯类似的性能。聚扁桃酸酯是通过在石油工业中生成的扁桃酸酯的环状二聚体的开环聚合化学合成的。当在含有1gL3HB钠和0.5gLD-扁桃酸酯的培养基中培养大肠杆菌XB201TBAL表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA时，生成聚55.2mol％3HB-共-43mol％D-苯基乳酸酯-共-1.8mol％D-扁桃酸酯，其量为干细胞重量的11.6wt％图8A和图8B。在本发明中，使用D-扁桃酸酯作为底物成功生成含有D-扁桃酸酯的芳香族共聚物，然后通过代谢工程体内生成D-扁桃酸酯。在表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL中表达以下基因：衍生自东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis的羟基扁桃酸合酶HmaS、天蓝色链霉菌S.coelicolor的羟基扁桃酸氧化酶Hmo、禾本红酵母Rhodotorulagraminis的D-扁桃酸脱氢酶Dmd，以从葡萄糖生成含有D-扁桃酸酯的芳香族共聚物。当在含有20gL葡萄糖和1gL3HB钠的培养基中培养工程改造的菌株时，生成聚92.9mol％of3HB-共-6.3mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-扁桃酸酯，其量为干细胞重量的16.4wt％。另一方面，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸酯-7-磷酸酯合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、编码D-乳酸脱氢酶的基因、编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因、和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是衍生自艰难梭菌630的hadA，并且聚羟基链烷酸合酶可以是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种6-19；或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。在本发明中，编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因可以是编码SEQIDNO:8所示氨基酸序列的基因，编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因可以是编码SEQIDNO:9所示氨基酸序列的基因，编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是编码SEQIDNO:10所示氨基酸序列的基因。在本发明中，编码羟基扁桃酸合酶的基因可以是编码SEQIDNO:11所示氨基酸序列的基因，编码羟基扁桃酸氧化酶的基因可以是编码SEQIDNO:12所示氨基酸序列的基因，以及编码D-扁桃酸脱氢酶的基因可以是编码SEQIDNO:13所示氨基酸序列的基因。本发明的微生物可以进一步导入参与3-羟基丁酰基-CoA生物合成的编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因，以使所述微生物即使在无外部补充3HB钠的情况下也能生成聚合物。另一方面，本发明涉及生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养所述重组微生物以生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和b回收所生成的具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。此外，在本发明中，为了证实使用本发明的重组菌株生成含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯的可能性，使用长链2-HA单体例如2-羟基异己酸酯2HIC、2-羟基己酸酯2HH和2-羟基辛酸酯2HO作为单体对聚合物产率进行鉴定。结果，鉴定了以下：生成含有2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯或2-羟基辛酸酯的共聚物，随着培养基中所含的2-HA浓度增加，所述共聚物中所含单体的摩尔分数增加表4、表5和表6。因此，另一方面，本发明涉及生成聚羟基链烷酸酯的方法，所述聚羟基链烷酸酯具有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体，所述方法包括：a在含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物的培养基中，培养能够生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的重组微生物；和b回收含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体的聚羟基链烷酸酯。在本发明中，使用3-羟基-3-苯基丙酸酯3HPh作为能够制备PHA的另一种芳香族单体来鉴定芳香族聚合物的生成。当在含有20gL葡萄糖、0.5gL3-羟基-3-苯基丙酸和1gL3HB钠的培养基中培养大肠杆菌菌株XB201TBA时，生成聚33.3mol％3HB-共-18mol％D-苯基乳酸酯-共-48.7mol％3HPh，其量为干细胞重量的14.7wt％图8C和图8D。这些结果表明，本发明中开发的HadA和突变的PHA合成可广泛用于生成各种芳香族聚酯。最后，对通过代谢工程改造的大肠杆菌生成的芳香族PHA的物理特性进行研究。所述聚52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯是无定形的，并且随着共聚物中D-苯基乳酸酯的摩尔分数增加，尽管分子量降低，但Tg显著增加至23.86℃。而且，在聚合物中含有芳香族化合物的所述共聚物具有降低的结晶度。认为所述聚合物的芳香环妨碍P3HB的结晶。P3HB由于其强结晶度而具有高脆度，而所得共聚物由于降低的结晶度和增加的Tg而具有改进的机械韧度。在本发明中，开发了针对生成各种芳香族聚酯的细菌平台系统。本发明的芳香族聚合物生成系统鉴定了一种新的CoA-转移酶针对将芳香族化合物活化成其CoA衍生物具有宽底物范围，并建立了能够聚合其芳香族CoA衍生物的PHA合酶突变体，以及通过代谢的设计和优化体内过量生成芳香族单体的途径。如在本发明的各种实施方案中使用若干种芳香族单体所证明的，所述系统可用于制备各种芳香族聚合物。例如，根据本发明，可以对HadA或相关的酶和PHA合酶进行工程改造以适应所述期望的芳香族单体。在本发明中开发的细菌平台系统可有助于针对由可再生非食物生物质生成芳香族聚酯的生物过程的建立。如本文所用，所述术语“载体”是指DNA产物，其含有与能够在合适宿主中表达DNA的控制序列可操作地连接的DNA序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。一旦用合适的宿主转化载体，它可以独立于宿主的基因组复制和起作用，或者可以经常与所述基因组本身整合。由于质粒是最常用的载体类型，因此所述术语“质粒”和“载体”有时在本发明的说明书中可互换使用。为了本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包括a有效进行复制的复制起点，以便每个宿主细胞包括若干个到数百个质粒载体，b用于筛选由质粒载体转化的宿主细胞的抗生素抗性基因，和c插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使不存在合适的限制性酶切位点，也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头容易地将所述载体和外源DNA连接。连接后，应将所述载体转化到合适的宿主细胞中。在本发明中，所述优选的宿主细胞是原核细胞。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌XL-1BlueStratagene、大肠杆菌B、大肠杆菌B21等。但是，还可以使用例如FMB101、NM522、NM538和NM539的大肠杆菌菌株，以及其他原核生物的种和属等。除了上述所说的大肠杆菌，以下菌株也可用作宿主细胞：农杆菌属Agrobacterium菌株例如农杆菌A4、芽孢杆菌属菌株例如枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、其他肠细菌例如鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium或粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens、以及各种假单胞菌属菌株。原核细胞的转化可以使用1.82部分中Sambrook等人，同上引文描述的氯化钙方法容易地进行。备选地，电穿孔Neumann等人.,EMBOJ.,1:841,1982可用于这些细胞的转化。用于根据本发明的基因过表达的载体可以是本领域已知的任何表达载体，并且优选地是基于pET的载体Novagen。当使用基于pET的载体进行克隆时，组氨酸基团与所述表达的蛋白质的末端结合，从而可以有效地纯化所述蛋白质。所表达的蛋白质可以通过本领域已知的通用方法从所克隆的基因分离，并且可以使用Ni-NTAHis-缀合的树脂Novagen使用色谱法进行特异性分离。在本发明中，所述重组载体可以是pET-SLTI66，并且所述宿主细胞可以是大肠杆菌或农杆菌。如本文所用，所述术语“表达控制序列”是指对于特定宿主生物可操作地连接的编码序列的表达到所必需的DNA序列。这种控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制此类转录的任何操纵基因序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译的终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选地包括操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。对所述质粒中基因表达水平具有最大影响的因子是启动子。优选地使用SRα启动子、巨细胞病毒衍生的启动子等作为高表达的启动子。可以将多种表达控制序列中的任何一种用于所述载体以表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域，3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶的启动子例如Pho5、酵母α-交配系统的启动子以及已知控制原核或真核细胞或病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。所述T7启动子可用于在大肠杆菌中表达本发明的蛋白质。当核酸序列基于功能性关系与另一核酸序列对齐时，它与其“可操作地连接”。这可以是一个或多个基因和一个或多个控制序列，其以这样的方式连接以便当合适的分子例如，转录激活子蛋白与所述一个或多个控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当表达为参与多肽分泌的前蛋白时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；以及当启动子或增强子影响序列的转录时，它与编码序列可操作地连接；或当核糖体结合位点影响序列的转录时，它与编码序列可操作地连接；或当所述核糖体结合位点定位以促进翻译时，其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指所述连接的DNA序列与其接触，或指分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，所述增强子不需要与其接触。这些序列通过在便利的限制性酶切位点处的连接联接进行联接。当不存在这样的位点时，使用根据常规方法的合成的寡核苷酸衔接体或接头。如本文所用，所述术语“表达载体”通常是指重组载体其中插入了异源DNA片段，并且一般是指双链DNA片段。其中，所述异源DNA是指在宿主细胞中不天然存在的外源DNA。一旦表达载体存在于宿主细胞中，它就可以独立于宿主染色体DNA进行复制，并且可以生成载体和插入的异源DNA的若干个拷贝。如本领域众所周知的，为了增加转基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应该与在选择的表达宿主中起作用的转录翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应的基因被包括在一个含有细菌选择标志物和复制起点的重组载体中。当宿主细胞是真核细胞时，重组载体还应在真核表达宿主中包括有用的表达标志物。通过上述重组载体转染或转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。如本文所用，所述术语“转染”是指将DNA导入宿主并使DNA可通过染色体外因子或染色体整合进行复制。如本文所用，所述术语“转化”是指表达载体被宿主细胞容纳，而不论是否实际表达了任何编码序列。应当理解，并非所有载体在表达本发明的DNA序列时都起相同作用。同样，并非所有宿主对同一表达系统都起相同作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从各种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择。例如，对载体的选择应该在考虑宿主的情况下进行，因为所述载体应该在其中复制。还应考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达例如抗生素标志物的表达。在选择所述表达控制序列时，应考虑许多因素。例如，特别关于可能的二级结构，应考虑所述序列的相对强度、可控性和与本发明的DNA序列的相容性。可以鉴于以下因素选择单细胞宿主：例如所选的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及易于由根据本发明的DNA序列编码的产物的纯化。在这些因子的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的各种载体表达控制序列宿主组合。作为克隆根据本发明的蛋白质的cDNA的筛选方法通过表达克隆，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，以下实施例仅提供用于说明本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。在以下实施例中，使用大肠杆菌作为重组微生物。然而，可以使用任何微生物而没有限制，只要它能够从碳源生成乙酰-CoA即可。所述微生物的实例包括产碱杆菌属Alcaligenes、假单胞菌属Pseudomonas、埃希氏菌属Escherichia、罗尔斯顿菌属Ralstonia、芽孢杆菌属Bacillus和棒状杆菌属Corynebacterium等。在本发明中使用或生成的重组菌株、质粒和引物示于表1至表3中。[表1][表2]1Datsenko,K.A.&Wanner,B.PNatlAcadSciUSA97:6640,2000.2Lee,K.H.等人.,MolecularSystemsBiology3,doi:ARTN14910.1038msb4100196,2007.3Palmeros,B.等人.Gene247:255,2000.4Park,S.J.等人.,MetabEng20,20,2013.5Yang,T.H.等人.BiotechnolBioeng105:150,2010.6Yang,T.H.等人.,ApplMicrobiolBiotechnol90:603,2011.7Choi,S.Y.等人.,NatBiotechnol34:435,2016.8Knobloch,K.H.&Hahlbrock,K.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics184:237,1977.9Kaneko,M.等人.,JBacteriol185:20,2003.[表3]实施例1：重组2-羟基异己酸酯CoA-转移酶的制备发现了使用乙酰-CoA作为CoA供体并具有广芳香族底物谱的酶。进行序列相似性分析以鉴定FldA的同源酶，并且从具有不同来源的各种FldA中筛选出艰难梭菌的2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA转移酶HadA，SEQIDNO:1，其与FldA的氨基酸序列同一性为48％或更高图2。为了生成含有编码HadA的基因的重组载体，使用艰难梭菌630菌株的染色体DNA作为模板，以HadA-hisF和HadA-hisR作为引物进行PCR，来生成编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的his_HadA基因片段，所述片段在其C末端具有his标签。接下来，用限制性酶NdeI和NotI处理由此生成的his_HadA片段以及pET22b质粒对T7启动子进行强的基因表达，然后使用T4DNA连接酶将限制性酶切割的his_HadA片段与pET22b质粒连接，以生成pET22b_hisHadA作为重组质粒图2。将所述pET22b_hisHadA导入大肠杆菌XL1-BlueStratageneCloningSystems，USA、培养并加入IPTG以诱导HadA表达。然后，在Ni-NTA离心试剂盒Quiagen，Germany中使用His标签在培养基中纯化HadA图3A。实施例2：鉴定2-羟基异己酸酯CoA-转移酶的底物多样性为了鉴定HadA是否能够使用乙酰-CoA作为供体，使用实施例1中制备的HadA进行体外测定。将10μgHadA加入到含有0.1mM乙酰-CoA和10mM底物的50mM磷酸盐缓冲液pH7.5中，并且反应在30℃下进行10分钟。反应后，加入0.1mM草酰乙酸、5μg柠檬酸合酶和0.5mM5.5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸DTNB。然后，通过测量412nm处的吸光度图3B来分析所释放的CoA的量。在配备有EclipseXDB-C18柱5μm,4.6x150mm,Agilent的LC-MSAgilent1100系列和LCMSDVL,Agilent上进行所得的脂肪族和芳香族酰基-CoA的分析。结果，从图4中可以看出，HadA能够使用乙酰-CoA作为供体，并能够使用扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸作为底物用于转换为相应的CoA衍生物。图5显示了可通过HadA转化的各种底物的CoA转化反应的分子式。实施例3：制备具有增加的芳香族单体产量的重组菌株将大肠杆菌工程改造以在体内从葡萄糖生成D-苯基乳酸酯。芳香族化合物的生物合成始于3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP的合成，其通过磷酸烯醇丙酮酸PEP和赤藓糖-4-磷酸E4P的缩合合成。将生成的DAHP转化为苯丙酮酸酯PPA，然后通过D-乳酸脱氢酶FldH将苯丙酮酸酯转化为D-苯基乳酸酯图1。已知针对芳香族化合物生物合成的代谢途径被各种抑制机制以复杂的方式控制。由aroG编码的DAHP合酶和由pheA编码的分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的表达被L-苯丙氨酸抑制Ribe,D.E.等人.,J.Bacteriol.127:1085,1976。在本发明中，构建抗反馈抑制的突变体AroGfbr[AroGD146N]和PheAfbr[PheAT326P]，以释放L-苯丙氨酸的反馈抑制Zhou,H.Y.等人.,Bioresour.Technol.101:4151,2010；Kikuchi,Y.等人.,Appl.Environ.Microbiol.63:761,1997。生成表达肉毒杆菌A菌株ATCC3502的AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue。为了构建pKM212-AroGfbr，使用AroG-F和AroG-R作为引物并使用pTyr-a质粒作为模板Na,D.等人.,NatureBiotechnol.31:170,2013，从3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因aroG抗反馈抑制的突变体获得PCR产物，并通过限制性酶切位点EcoRIHidIII将PCR产物连接到pKM212-MCSPark,SJ等人.,Metab.Eng.20:20,2013以生成pKM212-AroGfbr。所述pKM212-AroGfbrPheAfbr质粒构建如下。首先，使用PheA-F和PheAmut-R作为单突变核苷酸T976G的引物，通过PCR从大肠杆菌的基因组DNA扩增出991bp的DNA片段。其次，使用PheA-R和PheAmut-F作为单突变核苷酸A976C的引物，从大肠杆菌的基因组DNA中扩增出200bp的DNA片段。然后，使用PheA-F和PheA-R作为引物以及两个混合的片段作为模板，通过重叠PCR扩增出1161bp的DNA片段。使用限制性酶HindIII将PCR产物连接到以上生成的pKM212-AroGfbr。肉毒杆菌A菌株ATCC3502的D-乳酸脱氢酶fldH用于构建pACYC-FldH。fldH基因的密码子用法针对大肠杆菌进行了优化，使用FldH-F和FldH-R作为引物并以pUC57-FldHoptGenScript，Piscataway，NJ，USA作为模板扩增针对大肠杆菌优化的fldH基因。使用限制性酶BamHIHindIII将PCR产物与pTrc99APharmacia，Biotech，Sweden连接以构建pTrc-FldH。接下来，使用Trc-F和Ter-R作为引物并以pTrc-FldH作为模板，通过PCR扩增与trc启动子和rrnB终止子结合的fldH基因。使用限制性酶XhoISacI将扩增的PCR产物与pACYC184KS韩国专利公开号2015-0142304连接以获得pACYC-FldH。将由此生成的pKM212-AroGfbrPheAfbr和pACYC-FldH导入大肠杆菌XL1-Blue以生成表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的重组大肠杆菌。当在含有15.2gL葡萄糖的MR培养基中培养大肠杆菌时，其生成0.372gL的D-苯基乳酸酯。MR培养基每升含有6.67gKH2PO4、4gNH42HPO4、0.8gMgSO4·7H2O、0.8g柠檬酸盐和5ml痕量金属溶液，并且所述痕量金属溶液含有0.5MHCl：10gFeSO4·7H2O、2gCaCl2、2.2gZnSO4·7H2O、0.5gMnSO4·4H2O、1gCuSO4·5H2O、0.1gNH46Mo7O24·4H2O和0.02gNa2B4O7·10H2O。为了通过代谢工程增加芳香族单体的产量，通过代谢工程增加表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue菌株的得率，所述菌株从葡萄糖生成少量D-苯基乳酸酯0.372gL。通过缺失TyrR生成表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XBT菌株，TyrR是一种双转录调节剂，其执行调节以抑制芳香族氨基酸生物合成。使用一步灭活方法Datsenko,K.A.等人.,Proc.NatlAcadSci.USA97:6640,2000对表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌中的tyrR基因进行删除。在含有16.4gL葡萄糖的MR培养基中培养大肠杆菌XBT菌株。结果，所述菌株生成0.5gLD-苯基乳酸酯，这相当于产率比tyrR未被缺失的大肠杆菌XL1-blue菌株高30％。为了消除与D-苯基乳酸酯合成竞争的途径，通过从大肠杆菌XBT缺失poxB编码丙酮酸氧化酶的基因、pflB编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、adhE编码乙醛脱氢酶乙醇脱氢酶的基因和frdB编码富马酸还原酶的基因来构建大肠杆菌XB201T。大肠杆菌XB201T菌株从15.7gL葡萄糖生成0.55gL的D-苯基乳酸酯，这相当于得率比大肠杆菌XBT的高10％。此外，进行根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析以进一步增加D-苯基乳酸酯的生成。针对计算机模拟通量响应分析，使用大肠杆菌iJO1366基因组规模模型由2251个代谢反应和1135个代谢产物组成，并且研究了中心和芳香族氨基酸生物合成对D-苯基乳酸酯的生成的影响。为了在本发明的XB201T菌株中反映相同的情况，进一步向模型中加入D-苯基乳酸酯生物合成fldH基因的异源代谢反应，并将通量固定为零以反映模型中的基因敲除。使D-苯基乳酸酯生成的速率最大化至目标函数，而中心氨基酸和芳香族氨基酸生物合成反应通量值从最小值逐渐增加至最大值。在模拟期间，以一个小时为基础将葡萄糖反应速率设定为10mmol1g干细胞重量。使用GurobiOptimizer6.0和GurobiPy软件包GurobiOptimization,Inc.Houston,Tex.在Python环境中运行所有模拟。使用COBRApy32进行COBRA兼容SBML文件的读取、写入和执行。结果，如图6所示，从大肠杆菌菌株XB201T中去除编码酪氨酸氨基转移酶的tyrB基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，以减少L-苯丙氨酸的生物合成并从而增强碳向D-苯基乳酸酯的流动。作为计算机模拟通量响应分析的结果，发现制备的大肠杆菌菌株XB201TBA从18.5gL葡萄糖生成1.62gLD-苯基乳酸酯，导致得率大幅增加，即比表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-blue菌株的D-苯基乳酸酯产量高4.35倍。实施例4：用重组菌株制备含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯为了防止在XB201TBA中形成D-乳酸，进一步缺失ldhA基因以制备XB201TBAL菌株。为了制备含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯，将PhaC1437和HadA在大肠杆菌XB201TBAL菌株中表达。为了制备含有编码PhaC1437和HadA的基因的重组载体，使用HadA-sbF和HadA-ndR作为引物并以艰难梭菌菌株630的染色体DNA作为模板进行PCR，以生成编码羟基异己酸-CoA转移酶的hadA基因片段。使用限制性酶SbfINdeI将所述扩增的PCR产物与p619C1437-pct540连接Yang,T.H.等人.Biotechnol.Bioeng.105:150,2010以获得p619C1437-HadA。将获得的p619C1437-HadA导入大肠杆菌XB201TBAL以制备表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的重组大肠杆菌。在含有20gL葡萄糖和1gL3HB钠的MR培养基中培养大肠杆菌，获得聚52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的15.8wt％图7。此外，通过补料分批发酵制备聚52.3mol％3HB-共-47.7mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的24.3％图10A和10B。实施例5：使用重组菌株制备含有各种芳香族单体的聚羟基链烷酸酯为了鉴定使用大肠杆菌XB201TBAL的系统是否可用于制备各种芳香族共聚物，使用扁桃酸酯作为单体进行实验。将表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL在含有1gL3HB钠和0.5gLD-扁桃酸酯的MR培养基中培养。结果，生成聚55.2mol％3HB-共-43.0mol％D-苯基乳酸酯-共-1.8mol％D-扁桃酸酯，其量为干细胞重量的11.6wt％图8A和图8B，因此，使用D-扁桃酸酯作为底物成功地制备了含有D-扁桃酸酯的芳香族聚合物。接下来，通过代谢工程在体内制备D-扁桃酸酯。在表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL中表达以下基因：衍生自东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis的羟基扁桃酸合酶HmaS、天蓝色链霉菌S.coelicolor的羟基扁桃酸氧化酶Hmo、禾本红酵母Rhodotorulagraminis的D-扁桃酸脱氢酶Dmd，以从葡萄糖生成D-扁桃酸酯。为了构建pKM212-HmaS，使用东方拟无枝酸菌的羟基扁桃酸合酶基因hmaS并将密码子克隆到大肠杆菌中的合成载体GenScript，Piscataway，NJ，USA中，来制备质粒pUC57-HmaSopt。使用限制性酶EcoRIKpnI将所述pUC57-HmaSopt连接到pKM212-MCS。为了构建pKM212-HmaSHmo，使用天蓝色链霉菌的羟基扁桃酸氧化酶基因hmo合成密码子优化的hmo基因GenScript，Piscataway，NJ，USA，并使用Hmo-F和Hmo-R作为引物通过PCR对其进行扩增。使用限制性酶KpnIBamHI将所述PCR产物与pKM212-HmaS连接以构建pKM212-HmaSHmo。为了构建pKM212-HmaSHmoDmd，合成含有大肠杆菌密码子优化的dmd基因的pUC57-DmdGenScript，Piscataway，NJ，USA，并且使用Dmd-F和Dmd-R作为引物通过PCR对大肠杆菌密码子优化的禾本红酵母D-扁桃酸脱氢酶基因dmd进行扩增。使用限制性酶BamHISbfI将所述PCR产物与pKM212-HmaSHmo连接以制备pKM212-HmaSHmoDmd。将制备的pKM212-HmaSHmoDmd导入表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL，以构建具有生成扁桃酸酯的潜力的重组菌株。在含有20gL葡萄糖和1gL3HB钠的培养基中培养构建的具有生成扁桃酸酯的潜力的重组菌株。结果，生成聚92.9mol％3HB-共-6.3mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-扁桃酸酯，其量为干细胞重量的16.4wt％。鉴定了使用3-羟基-3-苯基丙酸酯3HPh作为另一种芳香族单体的芳香族聚合物的生成。当在含有20gL葡萄糖、0.5gL3-羟基-3-苯基丙酸和1gL3HB钠的培养基中培养大肠杆菌菌株XB201TBAL时，生成聚33.3mol％3HB-共-18mol％D-苯基乳酸酯-共-48.7mol％3HPh，其量为按重量计干细胞重量的14.7wt％图8C和图8D。这些结果表明，使用本发明开发的2-羟基异己酸-CoA转移酶的系统可广泛用于制备各种芳香族聚酯。实施例6：使用重组菌株制备含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯为了鉴定使用本发明的2-羟基异己酸-CoA转移酶的系统是否可用于生成含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯，使用各种长链2-HA单体[2-羟基异己酸酯2HIC，2-羟基己酸酯2HH和2-羟基辛酸酯2HO]对聚合物产率进行确认。在含有1gL3HB、20gL葡萄糖和不同浓度0.25gL、0.5gL和1gL的长链2-HA的MR培养基中对表达PhaC1437和HadA的大肠杆菌XL1-Blue进行培养。结果，制备了含有羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯或2-羟基辛酸酯的共聚物。另外，证实了随着培养基中所含的2-HA浓度增加，所述共聚物中所含单体的摩尔分数增加表4、表5和表6。[表4][表5][表6]实施例7：通过基于合成的启动子的通量控制制备含有各种摩尔分数的芳香族单体的聚羟基链烷酸酯为了在无外部供应3HB的情况下制备生成芳香族PHA的菌株，进一步在XB201TBAL菌株中表达真养雷氏菌β-酮硫解酶PhaA和乙酰乙酰-CoA还原酶PhaB，并且鉴定了在无外部补充3HB的情况下是否由葡萄糖生成芳香族PHA。结果，如所预期的，表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株由20gL葡萄糖生成聚86.2mol％3HB-共-13.8mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的18.0wt％。此外，通过使用合成的Anderson启动子http:parts.igem.org控制由PhaAB催化的代谢通量，尝试生成具有对工业应用重要的各种单体摩尔分数的芳香族PHA。制备用不同强度的五种不同启动子SEQIDNOS:89-93表达PhaAB的五种不同质粒，并将其导入表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株中。随着PhaAB表达的降低，D-苯基乳酸酯单体的摩尔分数增加；可以制备出具有11.0mol％、15.8mol％、20.0mol％、70.8mol％和84.5mol％的D-苯基乳酸酯的共聚物图9A和图9B和表7；通过用BBa_J23103启动子表达PhaAB，生成聚15.5mol％3HB-共-84.5mol％D-苯基乳酸酯，其量为干细胞重量的4.3wt％图9B。这些结果表明，通过控制代谢通量可以生成具有各种芳香族单体摩尔分数的芳香族聚酯。[表7]实施例8：通过补料分批发酵制备芳香族聚羟基链烷酸酯在本实施例中，在不提供3HB的情况下进行由启动子BBa_J23114控制的大肠杆菌菌株XB201TBAL表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB的pH稳态培养。培养96小时后，生成2.5gL的聚67.6mol％3HB-共-32.4mol％D-苯基乳酸酯，其聚合物含量为干细胞重量的43.8wt％图10C和图10D。此外，为了进一步改进芳香族聚羟基链烷酸酯的生成，通过用fldH基因替代大肠杆菌XB201TBA染色体的ldhA基因来对基因表达系统进行优化。另外，通过用强trc启动子替代ldhA基因的天然启动子，fldH基因的表达增加。进行补料分批发酵，包括使用脉冲进料方法进料葡萄糖。通过补料分批发酵，在启动子BBa_J23114下的大肠杆菌菌株XB201TBAF表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB生成13.9gL聚69.1mol％3HB-共-38.1mol％D-苯基乳酸酯，其聚合物含量为干细胞重量的55.0wt％图10E和图10F，并且13.9gL的产量比2.5gL在启动子BBa_J23114下的大肠杆菌XB201TBAL菌株表达AroGfbr，PheAfbr，FldH，HadA，PhaC1437和PhaAB生成的量高5.56倍，并且远高于通过大肠杆菌XB201TBAL菌株表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaC1437在补充有葡萄糖和3HB的培养基中的补料分批培养获得的量。这些结果表明，通过工程改造的菌株在BBa_J23114启动子下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA，PhaC1437和PhaAB的大肠杆菌XB201TBAF菌株的补料分批发酵，可以成功地以高浓度生成芳香族聚羟基链烷酸酯。实施例9：含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯的物理特性分析最后，对通过代谢工程改造的大肠杆菌生成的芳香族PHA的物理特性进行研究。通过GC或GC-MS测定聚羟基链烷酸酯PHA含量和单体组成。将收集的细胞用蒸馏水洗涤三次并冻干24小时，并通过酸催化的甲醇分解将冻干细胞的PHA转化为相应的羟甲基酯。使用配备有Agilent7683自动注射器、框架电离检测器和熔融石英毛细管柱ATTM-Wax，30m，ID0.53mm，厚度1.20μm，Agilent，USA的GC装置Agilent6890N，Agilent，USA对得到的甲酯进行纯化。通过氯仿提取对聚合物进行提取，并使用溶剂提取在细胞中对其进行纯化。使用核磁共振NMR，凝胶渗透色谱GPC和差示扫描量热法DSC测量所述聚合物的结构、分子量和热性特性能。作为结果，图7显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚3HB-共-D-苯基乳酸酯的分析结果，以及图8显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-D-扁桃酸酯的分析结果。聚52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯是无定形的，并且随着共聚物中D-苯基乳酸酯的摩尔分数增加，Tg显著增加至23.86℃尽管其分子量降低。而且，在聚合物中含有芳香族化合物的所述共聚物具有降低的结晶度。认为聚合物的芳香环妨碍P3HB的结晶由立体化学诱导。P3HB由于强结晶度而表现出高脆度，而所得共聚物由于降低的结晶度和增加的Tg而引起改进的机械韧性。尽管已经参考具体配置详细描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，该描述涉及优选实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附提交的权利要求及其等同物限定。【实用性】根据本发明，可以制备含有芳香族单体或长链2-HA单体的可生物降解的聚合物。尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，本详细描述是作为优选实施方案提供的，并不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附提交的权利要求及其等同物限定。【序列表自由文本】附有电子文件。序列表韩国科学技术院KOREAADVANCEDINSTITUTEOFSCIENCEANDTECHNOLOGY使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法PF-B2226PCTKR20180023052018-02-26KR10-2017-00262662017-02-28KR10-2017-01728992017-12-1593PatentInversion3.51399PRTHadA-艰难梭菌1MetLeuLeuGluGlyValLysValValGluLeuSerSerPheIleAla151015AlaProCysCysAlaLysMetLeuGlyAspTrpGlyAlaGluValIle202530LysIleGluProIleGluGlyAspGlyIleArgValMetGlyGlyThr354045PheLysSerProAlaSerAspAspGluAsnProMetPheGluLeuGlu505560AsnGlyAsnLysLysGlyValSerIleAsnValLysSerLysGluGly65707580ValGluIleLeuHisLysLeuLeuSerGluAlaAspIlePheValThr859095AsnValArgValGlnAlaLeuGluLysMetGlyIleAlaTyrAspGln100105110IleLysAspLysTyrProGlyLeuIlePheSerGlnIleLeuGlyTyr115120125GlyGluLysGlyProLeuLysAspLysProGlyPheAspTyrThrAla130135140TyrPheAlaArgGlyGlyValSerGlnSerValMetGluLysGlyThr145150155160SerProAlaAsnThrAlaAlaGlyPheGlyAspHisTyrAlaGlyLeu165170175AlaLeuAlaAlaGlySerLeuAlaAlaLeuHisLysLysAlaGlnThr180185190GlyLysGlyGluArgValThrValSerLeuPheHisThrAlaIleTyr195200205GlyMetGlyThrMetIleThrThrAlaGlnTyrGlyAsnGluMetPro210215220LeuSerArgGluAsnProAsnSerProLeuMetThrThrTyrLysCys225230235240LysAspGlyArgTrpIleGlnLeuAlaLeuIleGlnTyrAsnLysTrp245250255LeuGlyLysPheCysLysValIleAsnArgGluTyrIleLeuGluAsp260265270AspArgTyrAsnAsnIleAspSerMetValAsnHisValGluAspLeu275280285ValLysIleValGlyGluAlaMetLeuGluLysThrLeuAspGluTrp290295300SerAlaLeuLeuGluGluAlaAspLeuProPheGluLysIleGlnSer305310315320CysGluAspLeuLeuAspAspGluGlnAlaTrpAlaAsnAspPheLeu325330335PheLysLysThrTyrAspSerGlyAsnThrGlyValLeuValAsnThr340345350ProValMetPheArgAsnGluGlyIleLysGluTyrThrProAlaPro355360365LysValGlyGlnHisThrValGluValLeuLysSerLeuGlyTyrAsp370375380GluGluLysIleAsnAsnPheLysAspSerLysValValArgTyr3853903952559PRTPHA合酶-假单胞菌属物种6-192MetSerAsnLysSerAsnAspGluLeuLysTyrGlnAlaSerGluAsn151015ThrLeuGlyLeuAsnProValValGlyLeuArgGlyLysAspLeuLeu202530AlaSerAlaArgMetValLeuArgGlnAlaIleLysGlnProValHis354045SerValLysHisValAlaHisPheGlyLeuGluLeuLysAsnValLeu505560LeuGlyLysSerGlyLeuGlnProThrSerAspAspArgArgPheAla65707580AspProAlaTrpSerGlnAsnProLeuTyrLysArgTyrLeuGlnThr859095TyrLeuAlaTrpArgLysGluLeuHisAspTrpIleAspGluSerAsn100105110LeuAlaProLysAspValAlaArgGlyHisPheValIleAsnLeuMet115120125ThrGluAlaMetAlaProThrAsnThrAlaAlaAsnProAlaAlaVal130135140LysArgPhePheGluThrGlyGlyLysSerLeuLeuAspGlyLeuSer145150155160HisLeuAlaLysAspLeuValHisAsnGlyGlyMetProSerGlnVal165170175AsnMetGlyAlaPheGluValGlyLysSerLeuGlyValThrGluGly180185190AlaValValPheArgAsnAspValLeuGluLeuIleGlnTyrLysPro195200205ThrThrGluGlnValTyrGluArgProLeuLeuValValProProGln210215220IleAsnLysPheTyrValPheAspLeuSerProAspLysSerLeuAla225230235240ArgPheCysLeuArgAsnAsnValGlnThrPheIleValSerTrpArg245250255AsnProThrLysGluGlnArgGluTrpGlyLeuSerThrTyrIleGlu260265270AlaLeuLysGluAlaValAspValValThrAlaIleThrGlySerLys275280285AspValAsnMetLeuGlyAlaCysSerGlyGlyIleThrCysThrAla290295300LeuLeuGlyHisTyrAlaAlaIleGlyGluAsnLysValAsnAlaLeu305310315320ThrLeuLeuValSerValLeuAspThrThrLeuAspSerAspValAla325330335LeuPheValAsnGluGlnThrLeuGluAlaAlaLysArgHisSerTyr340345350GlnAlaGlyValLeuGluGlyArgAspMetAlaLysValPheAlaTrp355360365MetArgProAsnAspLeuIleTrpAsnTyrTrpValAsnAsnTyrLeu370375380LeuGlyAsnGluProProValPheAspIleLeuPheTrpAsnAsnAsp385390395400ThrThrArgLeuProAlaAlaPheHisGlyAspLeuIleGluLeuPhe405410415LysAsnAsnProLeuIleArgProAsnAlaLeuGluValCysGlyThr420425430ProIleAspLeuLysGlnValThrAlaAspIlePheSerLeuAlaGly435440445ThrAsnAspHisIleThrProTrpLysSerCysTyrLysSerAlaGln450455460LeuPheGlyGlyAsnValGluPheValLeuSerSerSerGlyHisIle465470475480GlnSerIleLeuAsnProProGlyAsnProLysSerArgTyrMetThr485490495SerThrGluValAlaGluAsnAlaAspGluTrpGlnAlaAsnAlaThr500505510LysHisThrAspSerTrpTrpLeuHisTrpGlnAlaTrpGlnAlaGln515520525ArgSerGlyGluLeuLysLysSerProThrLysLeuGlySerLysAla530535540TyrProAlaGlyGluAlaAlaProGlyThrTyrValHisGluArg54555055531065DNA人工序列AroGfbr3atgaattatcagaacgacgatttacgcatcaaagaaatcaaagagttacttcctcctgtc60gcattgctggaaaaattccccgctactgaaaatgccgcgaatacggttgcccatgcccga120aaagcgatccataagatcctgaaaggtaatgatgatcgcctgttggttgtgattggccca180tgctcaattcatgatcctgtcgcggcaaaagagtatgccactcgcttgctggcgctgcgt240gaagagctgaaagatgagctggaaatcgtaatgcgcgtctattttgaaaagccgcgtacc300acggtgggctggaaagggctgattaacgatccgcatatggataatagcttccagatcaac360gacggtctgcgtatagcccgtaaattgctgcttgatattaacgacagcggtctgccagcg420gcaggtgagtttctcaatatgatcaccccacaatatctcgctgacctgatgagctggggc480gcaattggcgcacgtaccaccgaatcgcaggtgcaccgcgaactggcatcagggctttct540tgtccggtcggcttcaaaaatggcaccgacggtacgattaaagtggctatcgatgccatt600aatgccgccggtgcgccgcactgcttcctgtccgtaacgaaatgggggcattcggcgatt660gtgaataccagcggtaacggcgattgccatatcattctgcgcggcggtaaagagcctaac720tacagcgcgaagcacgttgctgaagtgaaagaagggctgaacaaagcaggcctgccagca780caggtgatgatcgatttcagccatgctaactcgtccaaacaattcaaaaagcagatggat840gtttgtgctgacgtttgccagcagattgccggtggcgaaaaggccattattggcgtgatg900gtggaaagccatctggtggaaggcaatcagagcctcgagagcggggagccgctggcctac960ggtaagagca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权利要求：1.一种重组微生物，其是通过将编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸合酶的基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物所获得的，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。2.根据权利要求1的重组微生物，其中所述聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌Ralstoniaeutropha、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属物种Pseudomonassp.6-19，或是具有选自以下的氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。3.根据权利要求1的重组微生物，其中所述2-羟基异己酸-CoA转移酶是衍生自艰难梭菌Clostridiumdifficile630的HadA。4.根据权利要求1或权利要求2的重组微生物，其中所述2-羟基异己酸-CoA转移酶使用乙酰-CoA作为CoA供体。5.根据权利要求1的重组微生物，其中所述芳香族单体或长链2-HA单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯、4-羟基苯甲酸和扁桃酸酯。6.根据权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物被进一步导入有编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因。7.一种生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养根据权利要求1至6中任一项的重组微生物，以生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯，以及b回收所生成的具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。8.根据权利要求7的方法，其中在含有芳香族单体或长链2-HA单体的培养基中培养所述重组微生物。9.根据权利要求7的方法，其中所述芳香族单体或长链2-HA单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯、4-羟基苯甲酸和扁桃酸酯。10.一种重组微生物，其是通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物所获得的：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、和编码D-乳酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。11.根据权利要求10的重组微生物，其中所述2-羟基异己酸-CoA转移酶是衍生自艰难梭菌Clostridiumdifficile630的HadA。12.根据权利要求10的重组微生物，其中所述聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌Ralstoniaeutropha、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属物种Pseudomonassp.6-19，或是具有选自以下的氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。13.根据权利要求10的重组微生物，其中编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因是编码SEQIDNO:8所示氨基酸序列的基因。14.根据权利要求10的重组微生物，其中编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因是编码SEQIDNO:9所示氨基酸序列的基因。15.根据权利要求10的重组微生物，其中编码D-乳酸脱氢酶的基因是编码SEQIDNO:10所示氨基酸序列的基因。16.根据权利要求10的重组微生物，其中编码D-乳酸脱氢酶的所述基因是fldH基因。17.根据权利要求10的重组微生物，其中所述重组微生物被进一步导入有编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因。18.根据权利要求10的重组微生物，其中所述重组微生物具有选自以下的至少一种基因的缺失：tyrR基因、编码丙酮酸氧化酶的基因、编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、编码乙醛脱氢酶的基因、编码富马酸还原酶的基因、编码酪氨酸氨基转移酶的基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的基因。19.一种生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养根据权利要求10至18中任一项的重组微生物，以生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；以及b回收所生成的具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。20.一种重组微生物，其是通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物所获得的：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸DAHP合酶的基因、编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因、编码D-乳酸脱氢酶的基因、编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因、和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。21.根据权利要求20的重组微生物，其中所述2-羟基异己酸-CoA转移酶是衍生自艰难梭菌Clostridiumdifficile630的HadA。22.根据权利要求20的重组微生物，其中所述聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌Ralstoniaeutropha、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属物种Pseudomonassp.6-19，或是具有选自以下的氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列C1335；在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列C1310；和在SEQIDNO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列C1312。23.根据权利要求20的重组微生物，其中编码DAHP3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因是编码SEQIDNO:8所示氨基酸序列的基因。24.根据权利要求20的重组微生物，其中编码分支酸变位酶预苯酸脱氢酶的基因是编码SEQIDNO:9所示氨基酸序列的基因。25.根据权利要求20的重组微生物，其中编码D-乳酸脱氢酶的基因是编码SEQIDNO:10所示氨基酸序列的基因。26.根据权利要求20的重组微生物，其中编码羟基扁桃酸合酶的基因是编码SEQIDNO:11所示氨基酸序列的基因。27.根据权利要求20的重组微生物，其中编码羟基扁桃酸氧化酶的基因是编码SEQIDNO:12所示氨基酸序列的基因。28.根据权利要求20的重组微生物，其中编码D-扁桃酸脱氢酶的基因是编码SEQIDNO:13所示氨基酸序列的基因。29.根据权利要求20的重组微生物，其中编码D-乳酸脱氢酶的所述基因是fldH基因。30.根据权利要求20的重组微生物，其中所述重组微生物被进一步导入有编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因。31.一种生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：a培养根据权利要求20至30中任一项的重组微生物，以生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；以及b回收所生成的具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。32.一种生成聚羟基链烷酸酯的方法，所述聚羟基链烷酸酯具有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体，所述方法包括：a在含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物的培养基中，培养根据权利要求1至6中任一项的重组微生物；以及b回收含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体的聚羟基链烷酸酯。

百度查询： 韩国科学技术院 使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法

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