申请/专利权人：阅尔基因技术(苏州)有限公司;上海阅尔基因技术有限公司

申请日：2019-02-15

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN109666745B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6869

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2023.05.23#专利申请权的转移;2023.05.23#著录事项变更;2022.01.04#实质审查的生效;2019.04.23#公开

摘要：本发明公开了一种染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法，步骤包括：1）在1p和19q上选择相同数量的SNP位点；2）设计原始引物，将每条原始引物最靠近3’端但非末尾的T修改为U，若3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成多重扩增引物并溶解混合；4）多重PCR扩增；5）处理扩增产物，使U的单链形成一AP位点，再暴露出AP位点的5’磷酸和3’磷酸末端；6）测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p19q联合杂合性缺失。本发明基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p19qco‑LOH，不仅检测灵敏度、特异性和效率高，而且对样本限制小。

主权项：1.用于检测染色体1p19q联合杂合性缺失的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括：多重扩增引物、尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅷ，检测步骤包括：1在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；其中，1p和19q上各选择10个SNP位点，1p上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP位于19q13.3区段；2根据步骤1选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，所述原始引物的序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:40所示；然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3合成步骤2所得多重扩增引物，并进行溶解混合；4进行多重PCR扩增反应；5用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；6构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p19q联合杂合性缺失。

全文数据：染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒技术领域本发明涉及生物医学领域，特别是涉及染色体1p19q联合杂合性缺失的检测及用于该项检测的试剂盒。背景技术人类1号染色体短臂末端1p36和19号染色体长臂19q13.3区域内集中了许多与细胞生长调控以及增殖分化密切相关的重要基因。在脑胶质瘤中，染色体1p19q的联合杂合性缺失（Chr1p19qco-LOH）具有重要的临床意义。Chr1p19qco-LOH与组织学分型中的少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma）相关。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类中，推荐对该指标进行分子病理学检测（参见图1），这一指标对于低级别胶质瘤的病理分型具有重要意义，是低级别胶质瘤病理分型的重要依据。Chr1p19qco-LOH提示患者可能对烷化剂类抗肿瘤药物（如替莫唑胺）较为敏感，对同步放化疗较为敏感。统计数据表明，发生Chr1p19qco-LOH的胶质瘤患者预后较好（参见https:www.ncbi.nlm.nih.govpubmed23429602；https:www.ncbi.nlm.nih.govpubmed23071237）。Chr1p19qco-LOH的检测，目前主要有以下两种检测方法：第一种方法是荧光原位杂交FISH法。荧光原位杂交法是将带有荧光标记的DNA片段（FISH探针）与细胞核中的互补DNA序列进行杂交，利用显微镜观察产生的荧光信号，以此判断一种或多种靶标DNA序列的存在并确定其位置。在1p19q的热点缺失区域设计互补DNA序列，并在1p19q上设置内参区域的互补DNA序列，通过计算缺失区域与内参区域的荧光信号比值，可以检测1p19q的缺失情况。目前这是Chr1p19qco-LOH检测的金标准，但操作技术要求高、检测成本较高，且检测范围有限，只能检测已知片段。第二种方法是PCR毛细管电泳法。毛细管电泳法是近几年崛起的高效快速的分离分析方法，仪器能够检测到扩增产物所带引物的荧光信号，随后分离大、小分子，最主要的优点是快速、微量、分辨率高、重复性好、易于定量和自动化，分辨率可达1bp。在1p19q热点缺失区域的微卫星序列上设计引物，并在肿瘤样本和对照样本中分别进行PCR扩增，通过毛细管电泳比较扩增产物的分布情况，可以检测到相应区段是否发生缺失，进而判断1p19q的缺失情况。然而，由于微卫星的重复性，大多数二代测序平台都无法可靠地分析这些标记。二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）技术的发展，尤其是基于扩增子的NGS策略的成熟，使得检测成本持续下降，并让从微量DNA中获得DNA序列信息成为可能。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP）是已知的、由单个核苷酸的变异所引起的、可稳定遗传的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见的基因改变形式，在基因组中广泛分布。个体的SNP分为杂合型和纯合型，在完整的基因组中，纯合型SNP两个基因型的比例各为50%左右。当某一染色体区域发生杂合性缺失（LOH）时，区域内等位基因将发生失衡，杂合型SNP两个基因型的比例也将发生偏移，如图2所示。发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一种染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法，它操作简便，灵敏度和特异性高。为解决上述技术问题，本发明的染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法，步骤包括：1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；4）进行多重PCR扩增反应；5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p19q联合杂合性缺失。上述步骤1）中，一部分SNP选自通常用于判断常见缺失区段是否发生杂合性缺失的1p36.3区段和19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，以避免全部SNP均为纯合型的情况；该SNP在基因组中的距离大于300kb，以尽量减少相邻SNP互相连锁的情况。上述步骤2）中，所述原始引物的序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQIDNO:41～SEQIDNO:80所示。上述步骤3）所述多重扩增引物混合液的浓度优选为80µM，每条引物的终浓度优选为2µM。上述步骤4），PCR反应体系优选为：2×PlatinumMultiplexPCRMasterMix15µl，80µM多重扩增混合引物10µl，1ngµl样本DNA5µl，总体积30µl；PCR反应条件优选为：95℃2min；95℃30s，60℃90s，72℃20s，30个循环；72℃10min；4℃保持。上述步骤5），在产生5’磷酸和3’磷酸末端后，还可以进一步使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的序列全部切掉，以去掉引物的大部分对突变检出没有帮助、会浪费测序读长的序列。步骤5）中这三个酶反应可以在部分消化反应缓冲液的环境下，在PCR仪上同时混合进行，反应体系优选为：无核酸酶超纯水4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ0.5µl，T7核酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件优选为：37℃20分钟，10℃≤1小时。其中，所述部分消化反应缓冲液的组成成分优选为：500mM乙酸钾，150mMTris-乙酸，100mM乙酸镁，1gmlBSA，用乙酸调至pH7.9，25℃。上述步骤6），具体的判断方法的步骤包括：将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；识别杂合型SNP；如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生LOH，否则认为该位置发生了LOH；如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了LOH，则判定该位点所处染色体臂发生了LOH；当1p和19q均发生了LOH时，判断为该染色体发生了1p19q联合杂合性缺失；如果某条染色体臂上的所有SNP均为纯合型，则无法判断该染色体是否发生了Chr1p19qco-LOH。本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于上述染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法的试剂盒，该试剂盒包含有：依照前述方法设计并合成的多重扩增引物、尿嘧啶DNA糖基化酶以及核酸内切酶Ⅷ。进一步的，该试剂盒还可以包括有T7核酸内切酶Ⅰ等。所述多重扩增引物的序列优选为SEQIDNO:41～SEQIDNO:80所示的序列。本发明采用基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p19qco-LOH，通过对染色体1p19q范围内的SNP进行高测序深度的检测，筛选出杂合型SNP，并分析其两个基因型的比例，从而得到Chr1p19qco-LOH结果。与现有Chr1p19qco-LOH的检测方法相比，本发明的方法具有以下优点和有益效果：1.灵敏度和特异性高（灵敏度达到100%，特异度84.85%），操作简便，周转时间快（检测时间只需3天）；2.对样本限制小，可对任意组织样本（包括FFPE样本）中的极少量（低至10ng）DNA进行靶向测序；3.无需使用对照样本。因为在实际情况中，送检样本中必然包含正常细胞（如白细胞、间质细胞、癌旁组织等），杂合性缺失通常只发生于肿瘤细胞中，正常细胞染色体完整，因此总体的SNP杂合率虽然偏离了50%，但不会到达0%或100%，所以无需使用对照样本。附图说明图1是弥漫性胶质瘤基于组织学和遗传学特征进行分类的简化流程图。图中，*表示有其特征性，但不要求用于诊断；NOS表示非特指性，代表目前在病理学、遗传学和临床上尚缺乏足够认识的肿瘤，有待进一步的研究来细化分类。图2是发生LOH时，杂合型SNP的两个基因型比例将发生偏移。其中，（A）图为纯合型SNP，（B）图为杂合型SNP。图3是本发明实施例的LOH判定结果。具体实施方式为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例1基于多重扩增子的Chr1p19qco-LOH的高通量二代测序检测方法1.位点选择在1号染色体短臂（1p）和19号染色体长臂19q上各选择10个SNP，其中，1p上有5个SNP位于1p36.3区段，19q上有5个SNP位于19q13.3区段，这两个区域用于判断常见缺失区段是否发生杂合性缺失，结合其余SNP可以判断整个长臂或短臂是否发生杂合性缺失。每个SNP在东亚人群中的杂合率分布参考gnomAD_exome_EAS数据库。SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，以避免全部SNP均为纯合型的情况；SNP在基因组中的距离大于300kb，以尽量减少相邻SNP互相连锁的情况。最终选定的SNP位置如表1所示（人类基因组版本为GRCh37hg19）：2.引物设计根据表1中选择的位点，设计适用于多重扩增的引物（序列如表2所示）。然后将表2中每条引物最靠近3’端但不是末尾的T（脱氧胸腺嘧啶残基）修改为U（脱氧尿嘧啶残基），如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第二个T修改为U。按此方法修改表1中所有原始引物的序列，获得如表3所示的用于多重扩增的引物序列。3.引物合成合成表3中的各条引物，并溶解混合，确保混合液浓度为80µM，每条引物的终浓度为2µM。4.目标区域PCR扩增使用确诊为脑胶质瘤的手术组织样本。对于石蜡切片样本，使用Thermofisher的MagMAX™FFPEDNARNAUltraKit（A31881）提取样本DNA；对于组织样本，使用Promega的Maxwell®RSCTissueDNAKit（AS1610）提取样本DNA。使用Thermofisher的PlatinumMultiplexPCRMasterMix（货号4464268）对所提取的样本DNA进行多重PCR扩增。多重PCR扩增反应体系如表4所示，反应条件如表5所示。多重PCR扩增反应结束后，用1.8倍AgencourtAMPureXP磁珠纯化目的产物后，用水洗脱，洗脱体积14µl。5.部分消化扩增产物的引物区由于扩增引物靠近3’端有一个T改为了U，因此可以使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）处理，使U的单链形成一个AP位点（脱嘧啶位点）；再使用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；最后使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的序列全部切掉。这一方法可以去掉引物的大部分对突变检出没有帮助、会浪费测序读长的序列，并同时暴露扩增片段的5’磷酸末端，直接用于测序接头连接。以上3个酶反应可以在部分消化反应缓冲液的环境下，在PCR仪上同时混合进行，反应体系如表6所示，反应条件如表7所示。其中，部分消化反应缓冲液的组成成分为：500mM乙酸钾，150mMTris-乙酸，100mM乙酸镁，1gmlBSA，用乙酸调至pH7.9，25℃。反应结束后，用1.8倍AgencourtAMPureXP磁珠纯化目的产物，洗脱体积14µl。6.高通量二代测序用Thermofisher的Iontorrent进行测序。用Iontorrent的IonXpress系列接头来构建测序文库，并区分不同样本。具体步骤如下：（1）连接测序接头测序接头连接反应体系如表8所示，反应条件为：PCR仪上22℃孵育20分钟，72℃孵育10分钟。反应结束后，用1.8倍AgencourtAMPureXP磁珠纯化目的产物，洗脱体积23µl。（2）文库扩增PCR扩增体系如表9所示，扩增反应条件如表10所示。（3）磁珠片段分选步骤1，将BeckmanAgencourtAMPureXP磁珠提前室温放置30分钟，充分震荡混匀。步骤2，取0.5倍体积的磁珠（25µl），加入到文库扩增反应板中，吸打混匀10次，室温静置5分钟。步骤3，将PCR反应板置于磁力架上，待溶液澄清后，小心地将全部上清转移至新的0.2mlPCR管中，避免碰到磁珠沉淀。步骤4，取1.2倍原始体积的磁珠（60µl），加入上清中，吸打混匀10次，室温静置5分钟。步骤5，将PCR反应板置于磁力架上，待溶液澄清后，小心的吸去上清，避免碰到磁珠沉淀。步骤6，加入200µl新鲜配置的70%乙醇，贴着磁力架轻轻地左右移动PCR板来清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，并确保所有70%乙醇都被吸去。步骤7，保持在磁力架上，室温干燥3分钟，避免过度干燥。步骤8，从磁力架上取下，加入50µl无核酸酶超纯水，吸打混匀10次，使壁上的磁珠与水充分结合，室温静置2分钟。步骤9，将PCR板置于磁力架上2分钟，待溶液澄清后，小心的吸取48µl上清至新的PCR收集管中，避免碰到磁珠沉淀。本步骤获得的上清即为构建好的染色体1p19q联合杂合性缺失检测的测序文库。步骤10，进行文库定量，然后按Iontorrent测序流程进行二代高通量测序。（4）测序结果分析测序数据经与hg19序列比对，得到1p10个，19q10个的SNP等位型频率，根据频率的百分比来判别LOH发生情况。具体判读方法如下：1.杂合型SNP的识别。假设基因型为AB，纯合型SNP只表现出一种基因型（AA或BB），本申请将纯合型定义为95%～100%的A或95%～100%的B，在此频率范围之外的均为杂合型SNP，测序时会出现两种基因型。2.如果杂合型SNP两个基因型的比例在50%左右，偏移不超过5%，即45%～55%之间，则判定该SNP未发生LOH（即non-LOH），否则认为该位置发生了LOH。3.只要染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为LOH，则提示该位点所处染色体臂发生LOH，当1p和19q均为LOH时，判断为Chr1p19qco-LOH。4.如果某条染色体臂上的10个SNP在检测结果中均为纯合型，则该染色体的可用信息不足，无法判断是否发生了LOH。本实施例的LOH判定结果如图3所示，1号染色体短臂1p为LOH，19号染色体长臂19q为non-LOH，因此该染色体未发生Chr1p19qco-LOH。序列表领星生物科技（上海）有限公司上海领安生物科技有限公司启东领星医学检验所有限公司染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒LHJ-NP-18-10008880SIPOSequenceListing1.0121DNA人工序列ArtificialSequence1ggctttgcctgtagaagctct21222DNA人工序列ArtificialSequence2ctgcagtcagttctgagtgtga22320DNA人工序列ArtificialSequence3cctccgcatgcaaactggta20420DNA人工序列ArtificialSequence4ttggaccgggagacaggctt20530DNA人工序列ArtificialSequence5gaaactttattgccaatagtgagatgaacc30622DNA人工序列ArtificialSequence6gcgcctatctggatgtgttagg22721DNA人工序列ArtificialSequence7gctgtgagtggcaaggacttt21823DNA人工序列ArtificialSequence8tgagacccgagagttcacagtaa23922DNA人工序列ArtificialSequence9ctggtaagtgctgggagctatt221025DNA人工序列ArtificialSequence10gggcatctataattccaacctggtt251122DNA人工序列ArtificialSequence11gctatgccaccctaatccagac221224DNA人工序列ArtificialSequence12ccggctataaagtggactgaatgg241321DNA人工序列ArtificialSequence13ctcctgcagagcggctataag211421DNA人工序列ArtificialSequence14gacacagctagctgaagtcga211523DNA人工序列ArtificialSequence15atgaccttggaaatgcatccctt231626DNA人工序列ArtificialSequence16gggacaatgcagaaattaacaatcca261722DNA人工序列ArtificialSequence17cttcctggaagaggatctgcat221822DNA人工序列ArtificialSequence18ggccaagaagctcaaggagtac221924DNA人工序列ArtificialSequence19ttcctttgggcatgaagaaaaagc242029DNA人工序列ArtificialSequence20cccttgagatagcagtattctgtagaatt292125DNA人工序列ArtificialSequence21agcatcttccactaaactttccctt252229DNA人工序列ArtificialSequence22gatgtctaagacgtactgcattagctaaa292322DNA人工序列ArtificialSequence23cacttgccattcctcactggta222427DNA人工序列ArtificialSequence24ctgagaaatatagatgcgtgggtatgt272522DNA人工序列ArtificialSequence25gggatcccatatagtgcagagc222620DNA人工序列ArtificialSequence26attttctgccagacggtcca202721DNA人工序列ArtificialSequence27ccaccatcctctgggtctcat212822DNA人工序列ArtificialSequence28gggaccacacactgttatgatg222922DNA人工序列ArtificialSequence29gcgaccatggtaactacagcaa223022DNA人工序列ArtificialSequence30tttgtagctctgagcctgcatt223120DNA人工序列ArtificialSequence31aaggcctacggctcctatga203222DNA人工序列ArtificialSequence32caaagggattggaccatcctga223322DNA人工序列ArtificialSequence33gaggcagttcccagttagttcc223422DNA人工序列ArtificialSequence34atgacgcagacatcacggaaat223520DNA人工序列ArtificialSequence35cctgccttcataccggcttt203619DNA人工序列ArtificialSequence36gctggaaggtgacgagtgt193720DNA人工序列ArtificialSequence37gctgccctgagttgggatag203826DNA人工序列ArtificialSequence38tccctataggatggattccgttatcc263920DNA人工序列ArtificialSequence39gcattgtggaggccactgta204026DNA人工序列ArtificialSequence40acaaggagtatgaatggagtctgtga264121DNARNA人工序列ArtificialSequence41ggctttgcctgtagaagcuct214222DNARNA人工序列ArtificialSequence42ctgcagtcagttctgagtguga224320DNARNA人工序列ArtificialSequence43cctccgcatgcaaactggua204420DNARNA人工序列ArtificialSequence44ttggaccgggagacaggcut204530DNARNA人工序列ArtificialSequence45gaaactttattgccaatagtgagaugaacc304622DNARNA人工序列ArtificialSequence46gcgcctatctggatgtgtuagg224721DNARNA人工序列ArtificialSequence47gctgtgagtggcaaggactut214823DNARNA人工序列ArtificialSequence48tgagacccgagagttcacaguaa234922DNARNA人工序列ArtificialSequence49ctggtaagtgctgggagctaut225025DNARNA人工序列ArtificialSequence50gggcatctataattccaacctggut255122DNARNA人工序列ArtificialSequence51gctatgccaccctaauccagac225224DNARNA人工序列ArtificialSequence52ccggctataaagtggactgaaugg245321DNARNA人工序列ArtificialSequence53ctcctgcagagcggctauaag215421DNARNA人工序列ArtificialSequence54gacacagctagctgaagucga215523DNARNA人工序列ArtificialSequence55atgaccttggaaatgcatcccut235626DNARNA人工序列ArtificialSequence56gggacaatgcagaaattaacaaucca265722DNARNA人工序列ArtificialSequence57cttcctggaagaggatcugcat225822DNARNA人工序列ArtificialSequence58ggccaagaagctcaaggaguac225924DNARNA人工序列ArtificialSequence59ttcctttgggcaugaagaaaaagc246029DNARNA人工序列ArtificialSequence60cccttgagatagcagtattctgtagaaut296125DNARNA人工序列ArtificialSequence61agcatcttccactaaactttcccut256229DNARNA人工序列ArtificialSequence62gatgtctaagacgtactgcattagcuaaa296322DNARNA人工序列ArtificialSequence63cacttgccattcctcactggua226427DNARNA人工序列ArtificialSequence64ctgagaaatatagatgcgtgggtaugt276522DNARNA人工序列ArtificialSequence65gggatcccatatagugcagagc226620DNARNA人工序列ArtificialSequence66attttctgccagacggucca206721DNARNA人工序列ArtificialSequence67ccaccatcctctgggtcucat216822DNARNA人工序列ArtificialSequence68gggaccacacactgttatgaug226922DNARNA人工序列ArtificialSequence69gcgaccatggtaacuacagcaa227022DNARNA人工序列ArtificialSequence70tttgtagctctgagcctgcaut227120DNARNA人工序列ArtificialSequence71aaggcctacggctcctauga207222DNARNA人工序列ArtificialSequence72caaagggattggaccatccuga227322DNARNA人工序列ArtificialSequence73gaggcagttcccagttagtucc227422DNARNA人工序列ArtificialSequence74atgacgcagacaucacggaaat227520DNARNA人工序列ArtificialSequence75cctgccttcataccggctut207619DNARNA人工序列ArtificialSequence76gctggaaggtgacgagugt197720DNARNA人工序列ArtificialSequence77gctgccctgagttgggauag207826DNARNA人工序列ArtificialSequence78tccctataggatggattccgttaucc267920DNARNA人工序列ArtificialSequence79gcattgtggaggccactgua208026DNARNA人工序列ArtificialSequence80acaaggagtatgaatggagtctguga26

权利要求：1.染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；4）进行多重PCR扩增反应；5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p19q联合杂合性缺失。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该SNP在基因组中的距离大于300kb。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其中，1p上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP位于19q13.3区段。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQIDNO:41～SEQIDNO:80所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×PlatinumMultiplexPCRMasterMix15µl，80µM多重扩增混合引物10µl，1ngµl样本DNA5µl，总体积30µl；PCR反应条件：95℃2min；95℃30s，60℃90s，72℃20s，30个循环；72℃10min；4℃保持。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5），在产生5’磷酸末端和3’磷酸末端后，还包括有如下步骤：使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的序列全部切掉。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5），反应体系包括：无核酸酶超纯水4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ0.5µl，T7核酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件：37℃20分钟，10℃≤1小时。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5），所述部分消化反应缓冲液的组成成分为：500mM乙酸钾，150mMTris-乙酸，100mM乙酸镁，1gmlBSA，用乙酸调至pH7.9，25℃。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6），判断方法包括如下步骤：61）将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；62）识别杂合型SNP；63）如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生联合杂合性缺失，否则认为该位置发生了联合杂合性缺失；64）如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了联合杂合性缺失，则判定该位点所处染色体臂发生了联合杂合性缺失；65）当1p和19q均发生了联合杂合性缺失时，判断为该染色体发生了1p19q联合杂合性缺失；如果某条染色体臂上的所有SNP均为纯合型，则无法判断该染色体是否发生了联合杂合性缺失。10.用于权利要求1-9任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，包括：多重扩增引物、尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅷ。

百度查询： 阅尔基因技术(苏州)有限公司;上海阅尔基因技术有限公司 染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD