申请/专利权人：浙江工业大学

申请日：2023-12-12

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117867002A

主分类号：C12N15/78

分类号：C12N15/78;C12N15/31;C12N15/55;C12N1/21;B09B3/60;C08J11/10;C08L67/02;C12R1/38;B09B101/75

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.30#实质审查的生效;2024.04.12#公开

摘要：本发明公开了一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用，以假单胞菌Pseudomonassp.JY‑Q作为底盘细胞，使用假单胞菌JY‑Q的内源外膜蛋白OmpA外膜蛋白A及其变体作为锚定基序，将带有信号肽、靶蛋白、锚定肽的基因序列的重组表达质粒导入上述底盘细胞后得到工程菌株。该工程菌可以使fastpetase和mhetase基因在假单胞菌Pseudomonassp.JY‑Q中表达，并将这两个酶展示于细胞表面，表面展示的FASTPETase以及MHETase能有效地与底物接触，可作为全细胞催化剂应用于PET塑料降解中。

主权项：1.一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1以野生型假单胞菌Pseudomonassp.JY-Q的全基因组为模板，PCR扩增得到锚定蛋白compa片段，其基因序列如SEQIDNO.3所示；2以化学合成的，来自铜绿假单胞菌的锚定蛋白OprF的信号肽为模板，PCR扩增得到信号肽signaloprf片段，其基因序列如SEQIDNO.4所示；3以p519n质粒为模板，PCR扩增得到锚定蛋白gfp片段；4选择XbaI和EcoRI，作为酶切位点，将p519n质粒双酶切，按照TakaraDNA片段纯化试剂盒步骤对终止反应液进行纯化回收获得双酶切后的质粒；5将步骤1获得的锚定蛋白compa、步骤2获得的signaloprf信号肽以及步骤3获得的gfp片段和步骤4的酶切p519n质粒一步克隆，获得信号肽替换后的锚定蛋白signaloprf-compa，PCR扩增得到signaloprf-compa片段；6编码FASTPETase以及MHETase基因序列密码子优化后化学合成，PCR扩增得到目的蛋白基因片段，FASTPETase的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，MHETase的基因序列如SEQIDNO.2所示；7将步骤5和步骤6中获得的片段和酶切后的质粒进行酶连，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选阳性转化子，即可获得重组表达质粒；8以步骤7中获得的重组表达质粒经电转化导入到野生型假单胞菌Pseudomonassp.JY-Q的感受态细胞中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选，获得重组假单胞菌。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江工业大学 一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用

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