申请/专利权人：北京大学

申请日：2021-12-17

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114032292B

主分类号：C12Q1/6851

分类号：C12Q1/6851;C12Q1/6855

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.03.01#实质审查的生效;2022.02.11#公开

摘要：本发明公开了一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用。该方法将带有末端修饰的外源核苷酸片段插入至固定细胞基因组DNA双链断裂处，然后将基因组片段化并连接衔接接头，针对外源核苷酸片段和衔接接头设计特异性PCR引物和特异性荧光探针，结合细胞内参基因，构建数字液滴PCR体系，定量细胞内DNA双链断裂数量。本发明使得检测DNA双链断裂摆脱了序列依赖性，广泛适用于绝对精准定量动植物内因疾病、辐射、药物或者基因编辑等各种原因造成的DNA双链断裂数量，可用作检测射线损伤、化学药物损伤、基因编辑脱靶效率等问题的有效工具，在分子生物学和临床诊断中具有非常广阔的应用前景。

主权项：1.一种非诊断目的的绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法，包括以下步骤：1）进行细胞原位DNA双链断裂末端修复，然后连接外源核苷酸片段，所述外源核苷酸片段为双链核苷酸片段，长度为40~80bp，其正义链5'和3'端末位核苷酸均含有磷酸化修饰，反义互补链的3'端含有硫代磷酸修饰；2）提取并纯化细胞基因组DNA，然后进行超声片段化，对得到的基因组DNA片段末端修复后连接衔接接头，所述衔接接头为双链核苷酸片段，长度为10~60bp，其正义链3'端含有硫代磷酸修饰，反义互补链5'端末位核苷酸含有磷酸化修饰；3）纯化并回收选定长度范围内的基因组DNA片段；4）以外源核苷酸片段特异性荧光探针为检测信号，采用外源核苷酸片段特异性扩增引物以及衔接接头特异性扩增引物进行ddPCR，同时以内源参考基因特异性扩增引物和内源参考基因特异性荧光探针进行ddPCR；5）识别具有外源核苷酸片段特异性探针荧光信号的阳性液滴和具有内源参考基因特异性探针荧光信号的阳性液滴，统计它们的数量，经计算处理得到细胞中DNA双链断裂的绝对数量，具体方法是：首先统计每个反应中阳性液滴的数目f和一个反应中被接受的总液滴数目n，根据公式得到平均每个液滴中阳性液滴的数量λ；由此，根据不同的荧光信号识别出每个液滴中外源核苷酸片段阳性的总数量λ1和内源参考基因阳性的总数量λ3，则DNA双链断裂的总数量λ2=λ12，将λ3除以内源参考基因在基因组中的拷贝数得到λ4，最终获得平均一个细胞中含有的DNA双链断裂数量为λ2λ4；其中，步骤1）中的DNA双链断裂末端修复和步骤2）中对DNA片段末端修复是指进行末端补平、5'端磷酸化和3'端加A尾反应，得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 北京大学 一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用

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