申请/专利权人：华中农业大学;鲲羽生物科技(江门)有限公司

申请日：2022-02-07

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114480582B

主分类号：C12Q1/682

分类号：C12Q1/682;C12Q1/6844;C12N15/11;G01N21/64

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.05.31#实质审查的生效;2022.05.13#公开

摘要：本发明公开一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用，该方法将所有靶标分子分为锚定分子和N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。

主权项：1.一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，其特征在于：包括以下步骤：1待测靶标分子分类：选取待检对象中的靶标分子组成的靶标组，将靶标分子按其数量进行排序，选取排列在中间位置的1-5个靶标分子作为锚定分子；将除锚定分子外的靶标分子作为稀疏分子；并以稀疏分子的通量和数量为基准，将稀疏分子分为N个稀疏组，即为第一稀疏组…第N稀疏组，其中，N的取值满足在成像时每轮成像后的荧光信号在光学衍射极限内可分辨即可，N≥2；2杂交探针设计和制备从待检测对象的靶标分子中选出GC含量为40％～60％、特异性高、无高级结构的靶序列区域设计和制备杂交探针；其中，所述杂交探针包括锁式探针、RCA引发探针、读取探针和测序探针；其中，靶序列区域由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为检测区A’，loop序列和检测区B’，所述检测区A’的序列和检测区B’的序列分别与靶序列A和靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；Loop区从5’端至3’端依次为barcode1序列、读取探针结合序列L、barcode2序列和读取探针结合序列R；RCA引发探针由2部分组成，2部分分别为从5’端至3’端依次为与靶序列C互补的检测区C’，以及部分或全部的读取探针结合序列R的互补序列；所述barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，读取探针结合序列的长度为10-20bp；所述barcode1序列和barcode2序列均是由A、G、C、T四个碱基随机排列组合而成；若靶序列为锚定分子的靶序列时，其对应的读取探针Seq锚均相同，若靶序列为稀疏分子的靶序列时，从第一组至第N组，每一组对应的读取探针依次为Seq1探针，Seq2探针，……，SeqN探针；3探针预处理：对锁式探针的5’端进行磷酸化处理，再将其产物与RCA引发探针进行退火结合；对读取探针的5’端进行磷酸化处理；4样品杂交在反应腔室内依次对待检对象进行多聚甲醛固定、甲醇脱水和盐酸通透处理，再将含有锁式探针、RCA引发探针的杂交液加入反应腔室中孵育过夜；5连接反应通过连接酶的连接，使锁式探针与靶标分子的靶序列互补配对并形成闭合的环状结构6滚环扩增通过Phi29DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，连接过后的锁式探针闭合环状结构为模板，进行滚环扩增，放大信号；7原位测序解读空间信息1将N个稀疏组由第一组开始至第N组依次进行读取：a.第一轮读取：在T4连接酶的作用下，读取探针和测序探针进行连接测序反应，对锁式探针的barcode碱基进行测序，通过逐层成像，叠加信号进行最大投影，解读第一轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和第一组稀疏分子的barcode信息；使用信号剥离液去除读取探针和测序探针；b.其余轮读取：按上述步骤依次对其它稀疏组的锁式探针的barcode碱基进行测序，解读每轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息，直至解读完第N轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息；2解读空间信息a.根据锚定分子对应的荧光信号将N张图片进行配准重合形成一张图片，即为靶标组中的靶标分子对应的高密度荧光信息；b.将荧光信号与N组的barcode信息配对，将N组稀疏组的稀疏分子的barcode信息和锚定分子的barcode信息整合在一起，得到整合的所有稀疏组的barcode总信息；c.通过barcode总信息确定靶标组中的靶标分子高密度分布模式信息，然后进行细胞分割；最后进行单细胞数据分析；还原组织精细的分子构筑。

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