申请/专利权人：中南大学

申请日：2022-04-15

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114839025B

主分类号：G01N1/30

分类号：G01N1/30;G01N1/36;G01N1/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.08.19#实质审查的生效;2022.08.02#公开

摘要：本发明提供了一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其依次包括以下步骤：组织预处理、组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与烘片、脱蜡和组织复水、染色、脱水与透明、封片和观察。本申请最终切片对蛹组织内部各个器官的区分度高，能观察到嗜尸性蝇类蛹组织完整的空间结构，适用于有坚硬外壳、液体含量较高、固定液渗透较慢的嗜尸性蝇类蛹组织虫体；本染色方法处理嗜尸性蝇类蛹组织，在显微镜下可以清晰地观察到大脑、胸神经节、胸部肌肉、黄体、直肠袋、触角、咽扩张肌、性腺等蛹组织内部结构器官，且该方法具有操作简单、耗时短、成本低等优势；本申请还填补了嗜尸性蝇类蛹组织内部器官及组织观察的空白。

主权项：1.一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，其依次包括以下步骤：组织预处理：嗜尸性蝇类常规饲养，然后将发育到不同发育阶段的嗜尸性蝇类蛹放入装有1％的PBS缓冲溶液的培养皿中，将培养皿置于体视显微镜下，调整成适合的倍数和亮度，用昆虫针、尖头镊和弯头镊剥去蛹壳，然后将剥掉蛹壳的蛹内组织放入超纯水中清洗一遍；组织固定：将清洗后的蛹组织浸没在75％的乙醇固定液4℃固定24小时，然后转到Carnoy固定液中4℃固定12小时，再转到10％福尔马林固定液中常温固定12小时；组织脱水：首先将固定后的蛹组织取出，在室温条件下，用流水漂洗30min去除固定液残留，再将漂洗过的蛹组织通过不同梯度的乙醇溶液进行脱水，具体脱水过程为：70％、80％、90％、95％、100％无水乙醇溶液依次脱水，每个梯度的处理时间为30min；组织透明：将经过脱水处理后的蛹组织取出，室温下依次在二甲苯：乙醇为1:1的混合液、二甲苯：乙醇为2:1的混合液中浸泡10min，最后在100％二甲苯溶液中浸泡5min，进行透明处理；浸蜡、包埋与切片：将经过透明处理后的蛹组织取出，在55℃的液体石蜡：二甲苯为1:1的混合液中浸泡120min，再将其放入盛有纯石蜡溶液的包埋盒中浸泡240min；将浸好蜡的蛹组织于包埋机内进行包埋；于-20℃冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块，将修整好的蜡块放在切片机上固定，组织切片厚度为4-6um，用新的钢刀刀片对石蜡蜡块进行连续切片；展片与烘片：用眼科镊子镊起切好的石蜡切片轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平，待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中13和下13的中间，倾去载玻片上的余水，将切好的切片均匀的铺在烘片机上，温度设置为37℃，烘片；脱蜡和组织复水：取烘片后的载玻片先后分别浸泡在体积分数为100％二甲苯Ⅰ5min、100％二甲苯Ⅱ5min、100％乙醇溶液3min、95％乙醇溶液3min、90％乙醇溶液3min、80％乙醇溶液3min、70％乙醇溶液3min、蒸馏水浸洗5min，进行脱蜡和组织复水；染色：取组织复水后的载玻片分别浸泡在苏木精溶液中5min、蒸馏水中5min、返蓝液中1min、分化液中1min、伊红溶液中2min；脱水与透明：取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5min,再依次浸泡在浓度梯度为70％乙醇溶液2min、85％乙醇溶液2min、95％乙醇溶液2min、100％乙醇溶液2min进行脱水，然后浸泡在100％二甲苯Ⅰ2min、100％二甲苯Ⅱ3min透明；封片和观察：在染色完成的切片上滴加中性树胶,盖上盖玻片,置于通风橱中进行晾干后,在显微镜下观察。

全文数据：

权利要求：

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