申请/专利权人：湖南大学

申请日：2022-01-26

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114606295B

主分类号：C12Q1/682

分类号：C12Q1/682;C12Q1/26;G01N21/64

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.06.28#实质审查的生效;2022.06.10#公开

摘要：本发明公开了一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用，在I‑R3DNAzyme催化核心区引入甲基残基；与Substrate退火杂交，与去甲基化酶反应恢复DNAzyme的切割活性；加入锌离子，切割Substrate的特定位点，释放出靶向Cas12acrRNA的序列；加入含有非特异单链的Cas12a报告溶液，靶向激活Cas12a，Cas12a切割带荧光基团和淬灭基团的非特异性单链，使得荧光基团恢复荧光信号，通过监测荧光信号的变化达到检测去甲基化酶活性的目的。本发明的检测方法可以实现检测信号的多重放大，可实现多种去甲基化酶的检测以及对烷基化药物的疗效进行评估。

主权项：1.一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，包括以下步骤：S1、在I-R3DNAzyme催化核心区引入甲基残基获得甲基化的DNAzyme；将所述甲基化的DNAzyme与Substrate退火杂交，然后与去甲基化酶共孵育以去除DNAzyme上的甲基，恢复切割活性；S2、加入锌离子形成DNAzyme切割反应体系，切割所述Substrate的特定位点，释放出可靶向Cas12a-crRNA的序列；S3、加入含有非特异性单链的Cas12a报告溶液，所述可靶向Cas12a-crRNA的序列靶向激活Cas12a，从而切割所述非特异性单链，获得荧光信号，通过监测荧光信号的变化达到检测去甲基化酶活性的目的；所述S1中所述引入甲基残基为O6MeG；所述去甲基化酶为MGMT；所述DNAzyme为DNAzyme2、DNAzyme3或DNAzyme4时，所述Substrate为Substrate1；所述DNAzyme为DNAzyme1.1、DNAzyme2.1或DNAzyme3.1时，所述Substrate为Substrate2；所述DNAzyme2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述DNAzyme3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述DNAzyme4的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述DNAzyme1.1的核苷酸序列入SEQIDNO.6所示；所述DNAzyme2.1的核苷酸序列入SEQIDNO.7所示；所述DNAzyme3.1的核苷酸序列入SEQIDNO.8所示；所述Substrate1的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；所述Substrate2的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 湖南大学 基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用

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