申请/专利权人：南京周子未来食品科技有限公司;南京农业大学

申请日：2022-06-20

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114990056B

主分类号：C12N5/077

分类号：C12N5/077

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.09.20#实质审查的生效;2022.09.02#公开

摘要：本发明提供一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：采集猪脂肪组织，漂洗，消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；取含有脂肪祖细胞的单核细胞悬液，离心、细胞筛过滤、裂解、贴壁培养，取贴壁细胞即为含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；将猪脂肪祖细胞的单核细胞群进行流式分选，先选取出CD31和CD45阴性的细胞，再从前述细胞中选取出CD29和CD140a阳性的细胞，即为纯化后的猪脂肪祖细胞。应用本发明的纯化方法，可以稳定的获得高纯度的猪脂肪祖细胞。分离得到的猪脂肪祖细胞具有高效的分化效率。应用本发明的方法，可以为培养脂肪研究和实际生产提供大量的种子细胞来源。

主权项：1.一种猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）分离待纯化细胞样品：采集猪脂肪组织，漂洗，消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；（2）初步纯化：取含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液，离心、细胞筛过滤、裂解、贴壁培养，取贴壁细胞即为含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；（3）流式分选纯化：将步骤（2）得到的猪脂肪祖细胞的单核细胞群进行流式分选，所述流式分选的抗体为CD140a、CD29、CD31、CD45，先选取出CD31和CD45阴性的细胞，再从前述细胞中选取出CD29和CD140a阳性的细胞，即为纯化后的猪脂肪祖细胞；步骤（1）中，所述消化为将漂洗后的猪脂肪组织切碎，置于消化液中，使切碎的猪脂肪组织与消化液体积比为1:1~5:1，所述消化液为含0.5~5%Ⅰ型胶原酶和3vol%青霉素-链霉素双抗的1%牛血清白蛋白溶液，消化结束后，加入含10vol%胎牛血清和1vol%青霉素-链霉素双抗的DMEMF12的培养基终止消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；所述消化在30rpm~120rpm的转速震荡下操作；所述含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液可顺利通过30mL注射器针头；步骤（2）中，所述离心为在100~330g离心5~10min去除上层的成熟脂肪细胞，得到去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；步骤（2）中，所述细胞筛过滤为将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液依次经过200、70目的细胞筛过滤；步骤（2）中，所述裂解为将去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液离心去除上清后，用红细胞裂解液重悬，离心参数为300~500g离心5~10min，用红细胞裂解液重悬；室温裂解5~20min，加10倍体积PBS终止裂解后，300~500g离心5~10min，弃上清，得到去除红细胞、成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；步骤（3）中，所述流式分选包括配制抗体混合液，所述抗体混合液为将CD140a,CD29,CD31,CD45四种抗体与1%BSA以体积比1:10~1:200的比例混合，按照每毫升抗体混合液预处理106~5×107个细胞，将含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群与抗体混合孵育10~50min；孵育结束后，加入PBS，离心，用培养基重悬细胞，进行流式分选。

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