申请/专利权人：南京农业大学三亚研究院;南京农业大学

申请日：2024-01-05

公开（公告）日：2024-04-16

公开（公告）号：CN117517029B

主分类号：G01N1/30

分类号：G01N1/30;G01N1/28;G01N1/34;G01N1/36

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.16#授权;2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明公开一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，包括如下步骤，取材、固定、漂洗、脱水、树脂渗透、包埋、聚合、修块、半薄切片、工作液处理；优点是：采取一种新的脱水和渗透梯度，脱水、渗透更彻底，整个流程所需时间得到有效缩短；建立了一种工作液处理树脂切片的方法，使制成切片褶皱数量明显减少，切片质量大大提高，可进一步应用于图片定量分析；本发明克服了常规方法制作成熟期切片流程长，所制切片卷曲严重、无法完全展片以及褶皱数量多的缺点，可获得组织、细胞结构完整、清晰，反差明显的小麦成熟期籽粒树脂切片，并能进一步应用于图像定量分析，从而为研究小麦成熟期籽粒的结构和功能提供了准确的技术支持。

主权项：1.一种小麦成熟期籽粒的树脂切片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取材：选用成熟期小麦籽粒干种子，事先在水中浸泡使其软化；将软化的籽粒横切开，切取颖果中部2-3mm厚的组织块；S2、固定：将S1中的组织块浸泡在10%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中24h，使组织块内的组织和细胞充分固定；S3、漂洗：用10×PBS缓冲液漂洗多次固定后的组织块，以充分洗去固定液；S4、脱水：用25%-50%-75%-100%-100%乙醇水溶液对组织块逐级脱水，每级10min；S5、树脂渗透：用20%-40%-60%-80%-100%-100%伦敦白胶树脂对组织块进行逐级渗透，每级2h；S6、包埋：将渗透完的组织块放于包埋模具中，注入100%树脂；S7、聚合：将包埋模具放在烘箱内，60℃聚合1-2天；S8、修块：对包埋块进行手工修块，将组织块周围多余树脂削去；S9、半薄切片：用超薄切片机切厚度为1-2μm切片；S10、工作液处理：将工作液涂满载玻片表面，将切片转移至载玻片上反应1-2min；将装有切片的载玻片完全浸入水槽，使用新的载玻片捞取水面上的切片，将新的载玻片放到60℃加热板上干燥，使切片展平；S11、染色：S10中的切片经考马斯亮蓝G250染色，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像；其中，S10中，配制工作液方法为：加过量氢氧化钠于无水乙醇中，使用保鲜膜封口防止进入水分，过夜至溶液变黄，吸取上清溶液，得到饱和氢氧化钠无水乙醇溶液，将饱和氢氧化钠无水乙醇溶液与甲苯溶液按照3：1的比例混合而成，得到工作液；S10中，使用移液枪吸取200uL工作液加在载玻片上，摇动载玻片使工作液均匀分布载玻片上，用镊子夹取多个切片置于载玻片上反应1-2min，后将载玻片完全浸于60℃水槽中，切片立刻漂至水面上;S2中，固定液的配方为100mL10%的多聚甲醛溶液，250mL0.2mollpH7.4磷酸缓冲液和50mL2.5%的戊二醛水溶液；固定液固定温度为常温，用量为样品体积的10倍。

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权利要求：

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