申请/专利权人：北京工业大学

申请日：2022-02-12

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN114574579B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12Q1/682;C12Q1/6827

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2022.06.21#实质审查的生效;2022.06.03#公开

摘要：本发明涉及一种基于原位滚环扩增的脑胶质瘤基因突变的可视化分型方法。设计的蜗牛式探针可特异性靶向脑胶质瘤的标志物，耦合原位滚环扩增反应及荧光编码策略，实现单细胞水平多个基因突变的单分子检测。本方法取不同胶质瘤细胞为模型，以脑胶质瘤细胞的分子标志物基因作为特定靶标，构建基于多靶标单分子成像的功能分型体系。它包括以下步骤：1特异性蜗牛式探针与脑胶质瘤细胞中分子标志物基因的杂交；2基于原位滚环扩增的突变基因的单分子原位成像；3基于荧光编码的高通量原位检测，成像荧光信号。本方法可应用于细胞水平及脑组织切片水平中胶质瘤细胞的特异性识别及分型，针对肿瘤异质性进行单细胞水平信息提取、分析和可视化。

主权项：1.检测脑胶质瘤基因细胞标志物基因的试剂在制备基于原位滚环扩增的脑胶质瘤基因突变的可视化分型的产品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计可特异性靶向胶质瘤细胞标志物的蜗牛式锁环探针；（2）设计可提高原位空间定位的邻近引物primer探针；（3）设计荧光小分子探针，构建荧光编码策略进行多通量检测；（4）蜗牛式锁环探针与脑胶质瘤细胞的标志物RNA进行特异性识别和杂交；（5）加入T4DNA连接酶连接蜗牛式锁环探针5’端和3’端，使蜗牛式锁环探针成环；（6）加入primer、phi29DNA聚合酶进行滚环扩增实现信号放大；（7）荧光信号的检测：使用激光共聚焦荧光检测系统对四个通道进行多通量检测；（8）对荧光信号点进行数据统计，使用荧光编码策略对脑胶质瘤细胞或脑胶质瘤组织中的细胞进行可视化分型；所有反应均在37℃恒温箱中进行；所述步骤（1）为：挂锁式探针的全长为86~88nts，锁环探针的5’端和3’端各15nts特异性的靶向脑胶质瘤细胞标志物RNA的连续的30nts；5’连接点位置设计为目标基因突变点的互补碱基，以实现基因的单点突变检测；蜗牛式探针的其余位置设计为引物primer杂交模块22nts和小分子荧光探针的序列模块22nts；选取的脑胶质瘤细胞的标志物基因为：IDH基因的395位发生从G到A的突变，IDH1WT和IDH1MUT；ATRX基因的3773位发生从T到A的突变，ATRXWT和ATRXMUT；TERT基因228位发生从C到T的突变，TERTWT和TERTMUT；1号染色体短臂p36区域的D1S2666基因和19号染色体长臂q13区域的D1S412基因发生共缺失；分子标志物基因选取了连续30nts的长度且包含了上述的突变基因位点；所述步骤（2）的步骤为邻近引物primer序列设计为22nts长；所述步骤（3）中的基因分型的荧光编码策略是基于共聚焦荧光系统四个通道DAPI、FITC、Cy3.5、Cy5.5设计出对脑胶质瘤细胞标志物基因的8种基因分型方法，对脑胶质瘤细胞标志物基因的蜗牛式探针中的小分子荧光探针的序列所修饰的荧光染料进行了设计：IDH1WT修饰的荧光为AlexaFlour-488、IDH1MUT修饰的荧光为AlexaFlour-488和AlexaFlour-640、ATRXWT修饰的荧光为AlexaFlour-555、ATRXMUT修饰的荧光为AlexaFlour-555和AlexaFlour-640、TERTWT修饰的荧光为AlexaFlour-640、TERTMUT修饰的荧光为AlexaFlour-488和AlexaFlour-555、1p-D1S2666修饰的荧光为AlexaFlour-405、19q-D1S412修饰的荧光为AlexaFlour-405和AlexaFlour-640；所述步骤（4）中蜗牛式锁环探针与脑胶质瘤细胞中的RNA进行杂交的反应条件为37℃反应过夜；所述步骤（5）中T4DNA连接酶连接的反应条件为37℃，2h；所述步骤（6）中phi29DNA聚合酶的反应条件为37℃，2h；所述步骤（7）使用激光共聚焦荧光检测系统进行荧光信号检测，激光强度、电压、背景参数可调；所述步骤（8）使用荧光编码策略对脑胶质瘤细胞进行可视化分型，将DAPI通道添加蓝色伪彩，将FITC通道添加绿色伪彩，将Cy3.5通道添加灰色伪彩，将Cy5.5通道添加红色伪彩，通过荧光共聚焦系统进行可视化之后，联合荧光编码策略，IDH1WT基因呈现为绿色，IDH1MUT基因为绿色和红色的叠加呈现为黄色，ATRXWT基因呈现为灰色，ATRXMUT基因为灰色和红色的叠加呈现为淡红色，TERTWT基因呈现为红色，TERTMUT基因为灰色和绿色的叠加呈现为淡绿色，1p-D1S2666基因呈现为蓝色，19q-D1S412基因为蓝色和红色的叠加呈现为品红色。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 北京工业大学 一种基于原位滚环扩增的脑胶质瘤基因突变的可视化分型方法

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