申请/专利权人：天津科技大学

申请日：2023-03-07

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN116103419B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12M1/34;C12M1/00;C12R1/445;C12R1/42

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2023.05.30#实质审查的生效;2023.05.12#公开

摘要：本发明公开了一种标签特异性引物延伸辅助的基于Argonaute的通用型检测食源性致病菌的方法，包括如下步骤：在待检测食源性致病菌的正向引物5’端加入一段标签特异性通用序列Tag，并进行磷酸化修饰；然后通过PCR扩增将Tag序列引入到待检测对象的扩增产物上；再加入核酸外切酶I，纯化；将纯化后的PCR产物加入PfAgo反应体系中，如果产生可视化的绿色荧光，则证明存在，如果不产生，则证明不存在。本发明方法是基于Argonaute的通用型的一步法检测食源性致病菌的方法，通过核酸提取、核酸扩增、荧光信号读出三部分，即可用于检测食品等复杂样本中的致病菌。本发明方法检测灵敏，最低检测限为1CFUmL。

主权项：1.一种不以疾病的诊断和治疗方法为目的的核酸外切酶I辅助的基于Argonaute的通用型检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：在待检测食源性致病菌的正向引物5’端加入一段标签特异性通用序列Tag，Tag的基因序列为SEQIDNO.6，并进行磷酸化修饰，该段序列与荧光探针完全互补，荧光探针的DNA序列为SEQIDNO.5；然后使用该引物对待检测食源性致病菌进行PCR扩增；再加入核酸外切酶I，酶解消化剩余引物，对PCR产物进行纯化；将纯化后的PCR产物加入PfAgo反应体系中，如果产生可视化的绿色荧光，则证明存在食源性致病菌，如果不产生荧光信号，则证明不存在食源性致病菌；具体包括如下步骤：取待检测食品，向待检测食品中添加食源性致病菌的培养物，培养食源性致病菌；提取基因组；对梯度提取的基因组进行PCR扩增，使用的引物中的上游引物5’端磷酸化修饰tag；扩增后的产物加入ExoI，酶切消化掉未利用的引物，对PCR产物进行纯化；将纯化后的PCR产物作为guideDNA加入PfAgo反应体系中；反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3D检测装置中，获得检测结果；将纯化后的PCR产物加入PfAgo反应体系中具体步骤为：将扩增后的PCR产物与ExoI在37℃孵育10min，然后将其与PfAgo、荧光探针混合在反应缓冲液中，95℃下孵育45min；其中，PCR产物：ExoI：PfAgo：荧光探针的比例μL：μL：μM：nM为10：1：6：120，ExoI的浓度为20,000unitsmL；所述荧光探针为DNA序列，序列与Tag完全互补，5’端修饰FAM，3’端修饰BHQ1，其基因序列为SEQIDNO.5；所述反应缓冲液的组成为：pH7.5的Hepes-NaOH、NaCl和MnCl2的混合液，Hepes-NaOH：NaCl：MnCl2的摩尔比为20：100：0.5。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 天津科技大学 一种基于Argonaute的通用型一步法检测食源性致病菌的方法及应用

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