申请/专利权人：达姆施塔特技术大学

申请日：2017-11-10

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN109983132B

主分类号：C12Q1/00

分类号：C12Q1/00

优先权：["20161110 DE 1020161215538"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2019.09.13#实质审查的生效;2019.07.05#公开

摘要：本发明涉及一种测定试样中的分析物的浓度的方法，以及用于实施所述方法的一种试纸和一种试剂盒，以及一种测试系统，其包括所述试纸和检测器。本发明还涉及将所述方法用于测定试样中的分析物的浓度的应用。

主权项：1.一种测定试样中的分析物的含量的方法，包括以下步骤：a.制备至少一个分析溶液，i.其中所述至少一个分析溶液包括酶、信号产生底物以及待分析试样的已知比例，以及ii.其中所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争，b.对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测，其中所述信号i.通过在两个单独的分析溶液中通过所述信号产生底物的较高浓度的酶催化反应信号S1以及通过信号产生底物的较低浓度的酶催化反应信号S2产生，或者ii.通过所述信号产生底物的酶催化反应信号S1以及通过所述分析物的酶催化反应信号S2产生，或者iii.通过第一信号产生底物的酶催化反应信号S1以及第二信号产生底物的酶催化反应信号S2产生，c.根据所述信号计算反应因数，其中所述反应因数作为起始速度的商v0S2v0S1或作为其倒数v0S1v0S2计算，以及d.借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。

全文数据：带有内部酶活性补偿的酶底物的竞争性测试本发明涉及一种测定试样中的分析物的浓度的方法，以及一种用于实施所述方法的试纸条，以及一种包括所述试纸条和检测器的测试系统。此外，本发明还涉及所述测定试样中的分析物的浓度的方法的应用。作为凝血级联中的最终因子，纤维蛋白原具有核心意义。纤维蛋白原经凝血酶裂解。这是凝血级联中的步骤，该步骤导致纤维蛋白单体，并且因纤维蛋白单体的聚集而导致机械上尚且不稳定的血凝块的形成。取决于例如因手术或重伤造成的失血、例如因输液疗法造成的血液稀释或者凝血因子的消耗例如心脏外科或复杂的普外科手术期间的围手术期消耗，可能发生一般的凝血因子缺乏或隔绝的纤维蛋白原缺乏。由此可能引发严重的出血。在许多具有严重创伤的患者中，血液中的纤维蛋白原浓度迅速下降，并且低纤维蛋白原浓度是与有所升高的死亡率相关。在血浆外无纤维蛋白原储备。因此，在迅速下降的情形下，仅能通过人体自身的机制对纤维蛋白原水平进行不充分的标准化。故必须通过外部供给对缺乏加以补偿。为了对纤维蛋白原缺乏进行补偿，先前常采用新鲜冰冻血浆FreshFrozenPlasma，FFP。然而，这样一来总是涉及传播感染或者引发肾脏或多器官衰竭的危险。此外，在输入FFP时需要输入较大体积15-20mlkg体重，从而对患者的已承受巨大负荷的心血管系统进一步造成负荷，这可能导致严重后果。因此，越来越多地，不再为患者输入FFP，而是仅补充实际需要的形式为凝血因子浓缩物的物质。为了能够针对性地使用纤维蛋白原，必须在手术期间在几分钟内实施对纤维蛋白原含量的精确测定。现有技术中已揭示过各种用于测定纤维蛋白原浓度的测试，其中包括Clauss测试、例如借助进行的血栓弹性检测和通过重量分析法测定。标准纤维蛋白原测试为Clauss测试。通过过量的凝血酶对纤维蛋白原进行快速裂解。形成纤维蛋白，其凝结成血凝块，从而实现试样的可加以检出的浑浊度。直至浑浊度阈值为止的时间与纤维蛋白原浓度关联，故可将此时间用于测定纤维蛋白原浓度。但血液基质并非无影响；浑浊度以及直至阈值为止的时间均受影响。故期望较高的特异性。该测试需要经良好培训的实验室人员和相应的装备。在常规运行中，处理时间预计为约55分钟。这样一来，结果通常过于滞后，或不再反映当前情形。根据出血动态特性，在采血40分钟后，已呈现截然不同的纤维蛋白原浓度。在全球范围内，可以在手术室中或者在重症监护病房中实施TEM公司的测试。该测试基于血栓弹性检测。在约10分钟内获得结果。但就约1gL的介入阈值而言，该测试处于检出下限，因而不精确。此外，手术中的措施，如血浆增容剂的输入会对该测试产生严重影响。此外需要注意的是，用于实施血栓弹性检测的设备非常昂贵，故通常仅能在教学医院和其他非常大的医院中觅得。重量分析法的实施较为复杂，且需要的时间远高于Clauss测试。即便是在低浓度范围1.5gL内，目前也无法实现高精度的快速测试。然而，就有所降低的纤维蛋白原水平而言，这个浓度范围特别重要。因此，当前的针对创后出血患者的凝血管理的指导准则Rossaint等人，CriticalCare201620:100；第24和25页的建议28建议：借助3至4g的纤维蛋白原浓缩物实施“盲式”初步治疗，并且随后以此后获得的纤维蛋白原浓度测定结果为基础，对进一步的纤维蛋白原疗法进行调整。其中，主要是在妇科围产期出血、心脏外科心肺机上的手术期间的出血、移植外科特别是肝脏移植以及“内科”胃溃疡出血领域内有类似建议。亦即，由于缺少替代性的用于测定纤维蛋白原浓度的测试方法，当前必须容忍以下情形：因“盲式”初始治疗而在纤维蛋白原输入中发生超剂量或剂量不足，这可能有致命的影响。因此，存在对用于特别是在低浓度范围1.5gL内以高精度测定纤维蛋白原浓度的快速测试的迫切需求。已知的纤维蛋白原测试所基于的测试原理的特征为，通过凝血酶过量快速地产生纤维蛋白单体，该纤维蛋白单体的聚合随即产生信号。测得的信号可以以下形式存在：试样的浑浊度Clauss测试，试样的粘度增大血栓弹性检测或者能够以重量分析方式测定的血凝块形成。然而，出于上述原因，已知的测试方法中的任何一个均不适合应用在实践中，因为Clauss测试和重量分析法的时间需求过高，且血栓弹性检测在1.5gL的相对纤维蛋白原浓度范围内的精度不足，且诸如XIII因子的其他参数或者注入的胶体状输液会对测量值造成负面影响。根据本发明，能够克服这些问题。本发明的基础是使用与已知方法截然不同的测试原理。在本说明书中以纤维蛋白原浓度的测定为例阐释这个原理，但这个原理可泛用于底物浓度的酶动力学测定。本发明的解决方案在于，通过酶动力学方法测定纤维蛋白原浓度。通过凝血酶对纤维蛋白酶和产生信号的、特别是发色底物或荧光底物进行裂解。也可以生成电化学信号。借助信号产生底物的因酶引发的反应，产生信号物质，特别是色素、荧光团或者还原剂，其中对该信号物质的形成进行检测。例如通过测量在特定波长条件下的吸收或荧光，或者通过在经适当选择的电位下的电流来进行检测。纤维蛋白原和信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争。分析溶液中的纤维蛋白原越多，裂解的荧光底物便越少，即吸收的提升越平缓。这个竞争已在文献中揭示例如Mathur，Biochemistry1993，32，7568。这种酶竞争测试直接取决于酶活性，以及酶活性与测试温度的温度相关性。此外，酶的活性通常在测试的存放过程中下降。视时间和存放条件而定，残留活性是可变的。pH值和测量波长也是严重影响测试结果的因素。因此，需要非常精确地将所有这些条件保持在恒定水平，以便获得可靠的结果。特别是对于酶活性而言，这近乎是不可能的，故取而代之地，在原本的测定前需要以已知的纤维蛋白原浓度实施校准。但纤维蛋白原也并非更加稳定。校准溶液特别是与血液基质有很大区别，其又对凝血酶活性产生影响。故校准特别易于出错。额外的步骤也使得操纵更加复杂和缓慢。鉴于这些困难，现有技术中揭示的测定纤维蛋白原浓度的方法不以这种酶动力学竞争测试为基础。但本发明的发明人发现，当检测因酶的活性产生的两个不同的信号且随后将其相互结算，从而将诸如温度、pH值和酶活性的难以控制的影响因素的关联消除时，即使不进行复杂的校准，也能够通过这种竞争测试实现可靠的浓度测定。这理论上精确地适用于活性酶的量。就温度和pH而言，可能因KM值的变化而存在小的残余干扰。但这些残余干扰预计极小，特别是当发出信号的底物与分析物具有相似的结构时。试样中的额外的酶或者抑制剂活化剂也得到补偿，因为其相同地作用于两个测量。因此，本发明的原理的决定性优点在于对所有类型的干扰的简单补偿。原则上可通过不同的方案来实现本发明的原理。当信号产生底物的酶反应和分析物的酶反应均产生可测量的信号时，实现本发明的原理的方案为，例如在数个波长下并行检测这两个产生的信号，并对测得的值进行适当的结算。两个反应以相同的方式与酶活性和温度以及其他难以控制的影响因素相关，因为两个反应在同一分析溶液中进行。在此情形下，信号产生底物的反应用作内部标准。因此，如果以适当的方式相继得到测得的值，则能够一定程度上消除与这些影响因素的关联性，从而避免因难以控制的影响因素而造成的错误。然而，并非在所有情形下均在分析物的反应中通过酶产生可测量的信号。但由于本发明的原理是基于对因酶的活性而产生的至少两个不同信号的检测和结算，故在本发明的不通过分析物的反应提供可检测信号的实施方式中，必须通过产生信号的基质的反应产生两个信号。为此，至少有以下两种方案可供使用。一方面，可以在同一分析溶液中产生信号。但此举的前提是两个信号可区分。一种实现方案为，使用两个不同的信号产生底物，其在因酶引发的反应中引起可区分的信号。例如，可以在第一信号产生底物的因酶引发的反应中产生第一色素，并且在第二信号产生底物的因酶引发的反应中产生第二色素，其中第一与第二色素例如就其吸收最大值的波长而言有区别。同样地，两个反应以相同的方式与酶活性和温度以及其他难以控制的影响因素相关，因为两个反应在同一分析溶液中进行。因此，如果以适当的方式相继得到测得的值，则借助本发明的这些实施方式也能一定程度上消除与述及的影响因素的关联性，从而避免因难以控制的影响因素而造成的错误。另一方面，本发明的原理可通过以下方式实现：在信号产生底物的不同浓度下实施两个并行的酶反应。在这种实施方式中，优选在信号产生底物的一个极高浓度下实施一个反应。这样一来，测得的酶活性实际上与分析物的存在无关。因此，借助这个反应能够测定底物反应的最大起始速度vmax。另一反应则优选在信号产生底物的显著降低的浓度下实施。在此情形下，分析物更多地占据酶的结合位点，且信号产生底物的反应相应减少。在两种情形下，经反应的信号产生底物的量均同等程度地与酶活性以及温度相关。如果将测定的起始速度相除，则将与酶活性和温度以及其他影响因素的关联消除。这也适用于检测反应的不同灵敏性，例如通过诸如影响清除产物的荧光的物质实现。因此，即使是在低浓度范围1.5gL内，也能借助这些实施方式以高精度快速且可靠地测定纤维蛋白原浓度，而无需预先校准。本发明用以解决现有技术的问题的解决方案为权利要求书的标的。本发明用以解决问题的解决方案特别是在于一种测定试样中的分析物的含量的方法，包括以下步骤：a.制备至少一个分析溶液，i.其中所述至少一个分析溶液包括酶、信号产生底物以及待分析试样的已知比例，以及ii.其中所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争，b.对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测，c.根据所述信号计算反应因数，以及d.借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。本发明的方法用于测定试样中的分析物的含量。分析物原则上可以是所有能够酶反应的物质。所述分析物优选为肽，特别是多肽。所述分析物特别优选为蛋白质。根据本发明，单体和低聚蛋白质均适合充当分析物。在一个特别优选的实施方式中，所述分析物为纤维蛋白原。可选地，在制备所述至少一个分析溶液这个步骤前，本发明的方法包括制备待分析试样的步骤。但所述制备待分析试样的步骤优选不是本发明的方法的一部分。确切言之，借助所述方法能够对独立制备的试样进行分析。这个试样为待就分析物的含量加以分析的试样。原则上可以采用任何类型的试样。所述试样优选为含水试样。根据本发明，含水试样为具有至少25wt％、进一步优选至少40wt％、进一步优选至少45wt％、进一步优选至少49.5wt％比例的水的试样。所述试样优选选自由血液、尿液、唾液、奶和汗液构成的组。在优选实施方式中，所述试样为血样。但本发明的方法也可用于：就特定的可酶反应的分析物的含量对实验室溶液、食品提取物或者水样，特别是饮用水样进行分析。可以在制备分析溶液前对试样进行处理。例如，当预计分析物的浓度特别高时，可以将试样稀释。在测定原始试样中的分析物的含量时，必须将这个稀释因数考虑在内。优选地，在根据所述方法的步骤a使用的试样中，分析物的浓度处于0.1*Ki至100*Ki、优选0.2*Ki至20*Ki、进一步优选0.5*Ki至10*Ki的范围内，其中Ki为下述方程1至4针对分析物的因酶引发的反应的米氏Michaelis常数，该反应与发出信号的底物的反应竞争。对于述及的浓度而言，借助本发明的方法实现特别可靠的结果。在实施本发明的方法前，试样中的分析物的精确浓度是未知的。这个浓度需要通过所述方法测定。但本领域技术人员通常知道一个浓度范围，分析物的浓度可能性较高地处于该浓度范围内，故能够预先进行粗略估算。视分子量而定，优选的重量浓度可以有不同的值。对于优选的分析物而言，特别是对于纤维蛋白原而言，制备的试样中的分析物浓度优选处于0.05至20mgml、进一步优选0.1至10mgml、进一步优选0.2至5mgml、进一步优选0.5至4mgml的范围内。此外，当最初制备的试样的pH值可能对分析溶液中的酶活性造成阻碍时，例如也可以调整试样的pH值。优选地，根据所述方法的步骤a使用的试样的pH值处于6至9、进一步优选6.5至8.5、进一步优选7至8的范围内。特别优选地，根据所述方法的步骤a使用的试样的pH值处于相对所使用的酶的pH最佳值±1.5、进一步优选±1.0、进一步优选±0.5的范围内。根据本发明，所使用的酶的pH最佳值是酶具有最高活性时的pH值。优选地，所述制备的试样为液态试样，特别是含水试样。但也可以采用固态试样，例如粪便试样，土壤或岩石试样，或者粉末形态的试样。优选可以将可溶的固态试样直接用于制备分析溶液。作为替代方案，可以从固态试样提取分析物，并将获得的提取物作为试样的一部分用于制备分析溶液。在这类实施方式中，可以将提取物中的分析物的浓度用于测定固态试样中的分析物的含量。根据本发明的方法的步骤a，制备至少一个分析溶液，其包括酶、信号产生底物和试样的已知量。所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争。换言之，信号产生底物与分析物的因酶引发的反应竞争，且分析物与信号产生底物的因酶引发的反应竞争。亦即，分析物和信号产生底物相互为竞争者。本发明的至少一个分析溶液为水溶液，其允许分析物以及信号产生底物的因酶引发的反应。为此，可以根据相应酶的要求就组成和温度对所述分析溶液进行调整。特别是可以根据相应酶的要求调节pH值和或盐浓度。根据本发明，水溶液为具有至少50wt％、进一步优选至少75wt％、进一步优选至少90wt％、进一步优选至少95wt％比例的水的溶液。根据本发明的方法的步骤a，制备至少一个分析溶液。在本发明的优选实施方式中，制备正好一个分析溶液。在本发明的其他优选实施方式中，制备正好两个分析溶液。在特别优选的实施方式中，制备第一分析溶液A1和第二分析溶液A2，其中第一分析溶液A1和第二分析溶液A2各自包括酶、信号产生底物和试样的已知量，且其中第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度远低于第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度，优选至多为一半。当分析物的酶反应不提供可检测的信号，并且不存在在酶反应中提供可区分之信号的不同的信号产生底物时，这类实施方式是有利的。在这类实施方式中，通过信号产生底物的酶反应产生的信号S1和S2是不能相互区分的信号，故需要在两个单独的分析溶液中进行检测。所述不同的分析溶液优选包含相同量的酶。这样便无需额外的标准化步骤。此外，借此能够避免在反应之间视作恒定的参数受酶浓度影响。所述不同的分析溶液优选包含相同量的试样。这样便无需额外的标准化步骤。此外，借此能够避免在反应之间视作恒定的参数受分析物浓度影响。根据本发明，“相同量”这一表述表示偏差不超过±1％。根据本发明的方法的步骤a，所述至少一个分析溶液包括酶。根据本发明，所有能够使分析物以及产生信号的底部发生酶反应的酶均适用，其中至少通过信号产生底物的反应产生可检测的信号。优选地，所述酶选自由基于蛋白质的酶、核酶和脱氧核酶构成的组。特别优选地，所述酶为蛋白质。进一步优选地，所述酶选自由氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶构成的组。进一步优选地，所述酶选自由水解酶和转移酶构成的组。在存在适当的信号产生底物，其中化学官能的转移导致可测量的信号、特别是导致吸收或荧光的变化，且该底物能够与分析物发生竞争的情况下，可以将本发明的原理应用于转移酶。就水解酶而言，优选通过信号物质从信号产生底物的水解分裂产生信号。特别优选地，所述酶为水解酶。进一步优选地，所述酶为肽酶。进一步优选地，所述酶为丝氨酸蛋白酶。进一步优选地，所述酶选自由凝血酶和胰蛋白酶构成的组。进一步优选地，所述酶为凝血酶。根据本发明，所述至少一个分析溶液包括至少一个信号产生底物。所有能够通过所述酶发生反应并且通过反应产生可检出信号的底物均可用作信号产生底物。优选通过所述信号产生底物的酶反应形成信号物质。所述信号物质优选为色素。本发明范围内的色素是指能够通过光谱仪或光度计以光学方式检出的物质。本发明范围内的色素例如是吸收特定波长的光的物质，故能够在这个波长下测定随分析溶液的吸收变化的物质浓度。但本发明范围内的色素也可以是荧光团，即荧光组分，其不仅吸收特定波长的光，也发射波长较吸收波长更高的光，故能够检出随发射的光的程度变化的色素浓度。特别是可以通过转移酶、水解酶、裂解酶或者异构酶以酶方式产生荧光色素。在其他优选实施方式中，所述信号产生底物包含两个分子单元，其作为供体和受体形成FRET福斯特共振能量转移对。供体与受体优选以相互足够靠近的方式定位，以实现高效的FRET。其中供体为荧光团。受体为色素，其能够在供体的发射的波长范围内吸收光。在通过具有适当波长的光激发供体时，吸收的能量被传递至受体，故供体之荧光大幅减弱。受体可为荧光色素。在此情形下，在激发供体时，受体能够发射具有特征性受体发射波长的光。当受体并非荧光色素时，观察不到荧光。通过底物的酶切将供体和受体相互分离，从而对供体与受体之间的与距离紧密关联的能量转移进行阻碍，且供体的发射增强。但信号物质并不一定要是色素。根据本发明，特别是也可以采用可以电化学方式检出的信号物质。在信号物质能够被以电化学方式检出的实施方式中，优选采用信号产生底物，其包含底物结合、特别优选肽结合的p-氨基酚和或p-苯二胺残基。在适合的电位下，底物结合的残基不能氧化，而经裂解的自由胺则能良好氧化。因此，这类信号产生底物特别适合与水解酶配合使用。进一步优选地，将这些电化学的信号产生底物与肽酶配合使用。如上文所述，肽酶为本发明范围内的特别优选的酶。因此，根据本发明，特别优选的信号产生底物为通过肽键的断裂产生信号的底物。特别优选采用以下信号产生底物：其中肽键的断裂导致信号物质、特别是本发明范围内的色素的形成。特别优选地，所述信号产生底物包括对硝基苯胺基团，其通过氨基与氨基酸的羧基、特别优选与基本氨基酸的羧基、特别优选与精氨酸的羧基通过肽键连接。如果这个肽键因酶而断裂，则释放对硝基苯胺。在405nm的波长下，能够以光谱法检出对硝基苯胺的浓度。根据本发明，对硝基苯胺是一个特别优选的色素。根据本发明，特别优选的信号产生底物为N-苯甲酰-D,L-精氨酸-对硝基苯胺BAPNA以及寡肽底物Ala-Gly-Arg-对硝基苯胺和对甲苯磺酰基-Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺。通过选择其他肽，实际上能够选择所有已知的肽酶及其天然底物，从而将测试原理沿用至许多应用。特别优选也采用以下信号产生底物：其中肽键的断裂导致信号物质、特别是本发明范围内的荧光色素的形成。特别优选地，所述信号产生底物包括香豆素基团，特别是7-氨基-4-甲基香豆素基团，其通过氨基与氨基酸的羧基、特别优选与基本氨基酸的羧基、特别优选与精氨酸的羧基通过肽键连接。如果这个肽键因酶而断裂，则释放7-氨基-4-甲基香豆素。可以通过在约340nm波长下的吸收和约460nm波长下的发射以光谱法检出7-氨基-4-甲基香豆素的浓度。根据本发明，也可以采用以下实施方式：信号产生底物自身为本发明范围内的信号物质，其中这个信号物质因酶反应而降解。亦即，在这类实施方式中，检测到的信号为吸收的降低或者荧光的减弱。根据本发明，也可以采用以下实施方式：所述信号产生底物和通过信号产生底物的酶反应形成的物质均为信号物质，只要信号能够相互区分。例如，信号产生底物通常吸收特定波长的电磁辐射，而通过该信号产生底物的酶反应形成的信号物质则吸收另一特别是具有更大波长的辐射。根据本发明，也可以采用由信号产生底物与由其形成的信号物质构成的配对。根据本发明，所述至少一个分析溶液也包括所述试样的已知比例。本发明的原理在于，通过检测至少两个借助酶催化反应产生的信号以及随后对信号的结算测定试样中的分析物的含量。为了根据在所述至少一个分析溶液中产生的信号推断出试样中的分析物的含量，必须已知分析溶液中最初的试样比例。因此，为了成功地实施本发明的方法，分析溶液中包含的试样比例必须是已知的。根据本发明的方法的步骤b，对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测。信号类型取决于所使用的信号产生底物。所述信号优选为可光学检测的信号，特别是分析溶液中的吸收的变化或者荧光信号。吸收的变化特别是可以为消光系数的变化和或吸收最大值的变化。荧光信号特别是可以为量子产率的变化以及或者激发及或发射波长的变化。本发明范围内的可检出的信号不一定要是可光学检测的信号。根据本发明，也可以采用可以其他方式检出的信号，特别是可以电化学方式检测的信号。所述信号优选i通过信号产生底物的酶催化反应信号S1和通过分析物的酶催化反应信号2，或者ii通过信号产生底物的更高浓度的酶催化反应信号S1和通过信号产生底物的更低浓度的酶催化反应信号S2，或者iii通过第一信号产生底物的酶催化反应信号S1和通过第二信号产生底物的酶催化反应信号S2产生。亦即，根据述及的实施方式，就诸如温度或酶活性的难以控制的参数而言，在相似甚或相同的条件下产生两个信号S1和S2。根据本发明，通过检测两个信号以及随后对信号的结算，能够消除那些难以控制的因素的影响，从而能够以高精度快速且可靠地测定分析物的浓度，而无需预先校准。根据优选的实施方式，通过所述信号产生底物的酶催化反应产生信号S1，并且通过所述分析物的酶催化反应产生信号S2。在这类实施方式中只要能够将信号S1和S2相互区分开基于相互不同的产生信号的分子，即信号产生底物和分析物，通常是这样，便可在同一分析溶液中检测信号，故借助单独一个分析溶液便能成功地实施所述方法。根据其他优选实施方式，通过信号产生底物的更高浓度的酶催化反应产生信号S1，并且通过信号产生底物的更低浓度的酶催化反应产生信号S2。在这类实施方式中，两个信号S1和S2无法相互区分，因为其基于相同的产生信号的分子。因此，在这类实施方式中设有两个单独的分析溶液，用以实现对信号S1和S2的区分。亦即，在此类实施方式中制备第一分析溶液A1和第二分析溶液A2，其中在第一分析溶液A1中产生信号S1，并且在第二分析溶液A2中产生第二信号S2。“第一和第二分析溶液”概念并不表示这些分析需要先后或者以特定顺序进行。确切言之，优选并行地实施这两个分析。第一分析溶液A1和第二分析溶液A2各自包括酶、信号产生底物和试样的已知量。第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度高于第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度。优选地，与第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度相比，第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度至少为两倍，进一步优选至少为三倍，进一步优选至少为五倍，进一步优选至少为十倍，进一步优选至少为二十倍，进一步优选至少为五十倍。分析溶液中的信号产生底物的较大浓度差有助于可靠且低误差地测定分析物的浓度。第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度优选为达到酶饱和所需浓度的至少80％，进一步优选为至少90％，进一步优选为至少95％，进一步优选为至少99％，进一步优选为99.9％。信号产生底物的浓度越高，测得的信号便越稳定。就此而言，达到酶饱和所需的浓度是指第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度，从该浓度起，在信号产生底物的浓度增大10％时，信号的增大不超过0.1％。亦即，第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度优选相对较高。第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度优选为至少10*KM，进一步优选为至少25*KM，进一步优选为至少50*KM，进一步优选为至少100*KM，进一步优选为至少200*KM，其中KM为下述方程1至4米氏常数。第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度可以在相对较大的范围内变化。在值极低的情况下能够获得非常高的反应因数，但需要考虑到的是，反应速度非常低且相应地难以测量。因此，第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度处于优选1*KM至20*KM，进一步优选2*KM至10*KM，特别优选4*KM至8*KM的范围内，其中KM为下述方程1至4米氏常数。根据其他优选实施方式，通过第一信号产生底物的酶催化反应产生信号S1，并且通过第二信号产生底物的酶催化反应产生第二信号S2。这些实施方式与前述通过信号产生底物的酶催化反应产生信号S1，并且通过分析物的酶催化反应产生信号S2的实施方式相似。但根据在此描述的实施方式，不同于前述实施方式，并非通过分析物的反应，而是通过第二信号产生底物的反应产生第二信号。亦即，在这些实施方式中，分析溶液既包含分析物，也包含两个不同的信号产生底物。根据这些实施方式，通常可以在单独一个分析溶液中实施所述方法，前提条件是信号S1和S2能够相互区分。因此，即使分析物在酶反应中不提供可检测的信号，借助这些实施方式也能够在单独一个分析溶液中实施所述方法。但这些实施方式的前提条件在于，存在两个不同的信号产生底物，其在酶反应中导致可区分的信号。在特别优选的实施方式中，信号S1和信号S2均不通过分析物的酶催化反应产生。换言之，特别优选地，信号S1和信号S2均通过至少一个信号产生底物的酶催化反应产生，其中所述分析物不是信号产生底物。根据本发明的方法的步骤c，根据检测的信号计算反应因数。优选如下根据信号计算反应因数：根据信号测定信号产生底物的酶反应的起始速度v0S1和v0S2，并且将这些起始速度v0S1和v0S2相互结算。特别优选地，将反应因数作为商v0S2v0S1或其倒数v0S1v0S2计算。针对竞争性抑制的最简单情形，信号产生底物的酶反应的起始速度v0如下得出：方程1其中，vmax是最大反应速度，其等于周期数kcat与活性酶浓度[E]0的乘积。[S]是信号产生底物的浓度。KM是信号产生底物的因酶引发的反应的米氏常数。Ki是分析物的因酶引发的反应的米氏常数。由于分析物充当信号产生底物的反应的抑制剂，在本发明中也将Ki称作抑制剂常数。[I]是分析物的待测定浓度。在本说明书中，“Ki”和“KI”的含义相同。根据测得的信号能够测定起始速度v0。这一点最好为本领域技术人员所知。由于使用的信号产生底物的量是已知的，故浓度[S]也是已知的。KM和Ki是可通过实验测定的量，其需要通过校准实验借助信号产生底物以及分析物的浓度级数测定。但仍无法根据起始速度v0简单地测定分析物的浓度[I]，因为信号产生底物的最大反应速度vmax是未知的。如上文所述，不同于诸如KM和Ki的其他参数，就vmax而言，通过适当的校准实验进行的预先测定并无帮助，因为vmax很大程度上取决于难以控制的影响因素，如温度、酶活性和复杂试样基质的属性。因此，在本发明中根据检测的信号来计算反应因数。这个反应因数基本上与难以控制的影响因素无关，因为这些影响因素以相同的方式影响第一信号S1的测量和第二信号S2的测量，故可通过将信号结算成反应因数来消除。当在反应中有非常多的信号产生底物和非常少的分析物，使得信号产生底物的反应的起始速度v0等于最大反应速度vmax时例如v0S1＝vmax，能够特别简单地计算出反应因数。当第一分析溶液A1中的酶和分析物浓度等于第二分析溶液A2中的酶和分析物浓度时，在这种情形下反应因数U如下得出：方程2当然，也可以采用倒数1U来替代U。通常情况下，针对换算因数的公式为：方程3在无分析物的情况下[I]＝0，U的值为对于较大量的分析物而言，U接近限值[S2][S1]。亦即，通过第一与第二信号产生底物的浓度比测定动态宽度。浓度差越小，动态宽度便越小，且斜率也越平缓。U[I]的一般曲线图如图1所示。倒数给出具有正斜率的反向曲线图。对于较小的分析物浓度[I]而言，函数U[I]近乎呈直线延伸，并可通过泰勒级数的前两项逼近：方程4对于[I]而言，Ki区域内的斜率最大，在这个区域内能够以最大的精度测定分析物浓度。亦即，当v0S1明显远离vmax时，可以将通过求两个起始速度v0S1和v0S2的商进行的U测定用于可靠地测定分析物的浓度。但v0S1优选为至少0.5*vmax，进一步优选为至少0.8*vmax。因此，第一分析溶液A1中的酶和分析物的浓度优选等于第二分析溶液A2中的酶和分析物的浓度，以实现反应因数的尽可能简单的计算。在第一分析溶液A1中的酶和分析物的浓度不等于第二分析溶液A2中的酶和分析物的浓度的实施方式中，必须将更多的标准化因数导入以上方程。然而这对于本领域技术人员而言在计算方面并非轻而易举。但需要考虑到的是，在使用不同的分析物量以及试样量时，也会有不同浓度的干扰性试样成分进入分析溶液1和2。故这种实施方案并非优选方案。根据本发明的方法的步骤d，借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。与最上的用于测定起始速度v0的方程1相比，在上述用于测定作为v0S2与v0S1的商的反应因数U的方程2至4中，将参数vmax消除。由于根据检测的信号计算反应因数U，且参数[S]、KM和Ki如上文所述是已知的，能够测定分析溶液中的分析物的浓度[I]，并且由于分析溶液包含试样的已知比例，也能够借助计算出的反应因数测定试样中的分析物的含量。根据特别优选的实施方式，结合基于经验的校准曲线来测定分析物的浓度。优选通过在分析物的不同浓度下测定反应因数来获得这种校准曲线。这样便能测定反应因数与分析物的浓度的关联性，从而根据针对未知的试样获得的反应因数推断出这个试样中的分析物的浓度。针对[I]≥Ki的情形获得特别可靠的结果。分析溶液中的分析物的浓度[I]优选为至少1*Ki，进一步优选为至少2*Ki，进一步优选为至少5*Ki，进一步优选为至少10*Ki。但分析溶液中的分析物的浓度[I]不应过大，否则与信号产生底物的竞争会非常大，进而导致信号强度减小。分析溶液中的分析物的浓度[I]优选为至多1000*Ki，进一步优选为至多500*Ki，进一步优选为至多200*Ki。其中，Ki为上述抑制剂常数。第二分析溶液A2中的商[S]KM与商[I]Ki的比例处于优选0.1至10、进一步优选0.2至5、进一步优选0.5至2、进一步优选0.8至1.2的范围内。特别优选地，第一分析溶液中的商[S]KM与商[I]Ki的比例约为1:1。换言之，第二分析溶液A2中的分析物与信号产生底物的浓度比特别优选如同Ki与KM的比例。在第一分析溶液A1中，商[S]KM与商[I]Ki的比例则处于优选10至1000、进一步优选20至500、进一步优选50至200、进一步优选80至120的范围内。这样一来，借助本发明的方法能够以高精度快速且可靠地测定分析物的浓度，无需预先校准。可以通过标准实验室设备来实施本发明的方法。优选在比色皿中或者在微量滴定板中制备所述分析溶液。特别是也在这些容器或者类似的容器中实施测量。在产生的信号为可光学检测的信号的情况下，上述方案能够简化对信号的检测。但也可以借助本发明的试纸来实施本发明的方法。此举的优点特别是在于，即使经验较少的人员也能顺利地实施所述方法，甚至可以在手术现场，在急诊室中，在手术室、产房或者重症监护病房中直接实施，例如用以测定纤维蛋白原浓度。本发明的试纸具有多层结构。其中酶与底物必须分隔存在。本发明的试纸具有至少两个层。所述试纸具有优选至少三个，进一步优选至少四个，进一步优选至少五个，进一步优选至少六个层。但所述试纸具有优选至多十个，进一步优选至多八个层。否则结构会非常复杂且进而易于出错。本发明的试纸包括至少一个包含酶的酶层，以及至少一个包含信号产生底物的底物层。其中，所述酶与所述信号产生底物不相互接触，故不发生信号产生底物的因酶引发的反应。但在将含水试样施涂至试纸的情况下，这个试样穿过酶层和底物层扩散，并将固定在试纸的经分隔的层中的酶和信号产生底物溶解，使其发生接触，从而形成本发明的分析溶液。随后可以通过至少一个开口观察在分析溶液中产生的信号，所述开口可以选择性地被透明的保护层盖住。视实施方式而定，本发明的试纸可以具有一个或一个以上、优选两个底物层。在分析物自身的酶反应导致可检测的信号的情况下，可以如上文所述将通过信号产生底物的酶催化反应以及通过分析物的酶催化反应产生的信号用于计算反应因数，进而用于测定试样中的分析物的含量。在这些信号能够相互区分开的前提条件下，信号产生底物的酶反应和分析物的酶反应可以在同一分析溶液中发生。因此，在这类实施方式中一个底物层便已足够。这同样适用于使用两个不同的信号产生底物的实施方式，这些底物在酶引发的反应中导致能够相互区分开的信号。即使是在这类实施方式中，也可以在同一分析溶液中实施两个底物的反应，故一个底物层便已足够。在其他优选实施方式中，特别是当分析物自身的酶反应不导致可检测的信号，并且仅有一个信号产生底物可供使用时，需要两个可相互分开读取的底物层，因为两个待检测的信号无法相互区分开。因此，在这类实施方式中，本发明的试纸具有至少两个可相互分开读取的底物层，优选具有正好两个可相互分开读取的底物层。所述底物层优选包含不同量的信号产生底物。进一步优选地，一个底物层包含较高量的信号产生底物，且另一底物层包含较少量的信号产生底物。特别优选地，所述一个底物层中的信号产生底物的量与另一底物层中的信号产生底物的量相比至少为两倍，进一步优选至少为三倍，进一步优选至少为五倍，进一步优选至少为十倍，进一步优选至少为二十倍，进一步优选至少为五十倍。信号产生底物在不同底物层中的较大的量差别有助于可靠且低误差地测定分析物的浓度。重要之处在于，这两个底物层如此相互分隔，使得即使在试样穿过层扩展时也不会发生混合。因此，不同的底物层优选在试纸中并排设置，而酶层与底物层则“依序”设置，即重叠或交叠设置，从而确保底物和酶因扩展的试样而发生混合。本发明的试纸优选包含至多两个酶层，进一步优选包含正好一个酶层。即使是在试纸具有两个底物层的实施方式中，也优选设有仅一个酶层。在这类实施方式中，所述酶层优选设置在底物层上方，使得施覆至试纸的试样首先穿过酶层，随后才扩散进入并排设置在该酶层下方的底物层。这样便能防止产生的分析溶液的混合。除酶层和底物层以外，本发明的试纸可以包含其他层。所述试纸优选包含施涂层，试样被施涂至该施涂层。可选地，在所述施涂层下方可以设有分隔层，其在试样扩散进入酶层和底物层前特别是拦截细胞成分。当所述试样为血样时，上述方案特别有利。可以通过一或数个粘接层以及或者通过一个将其他层包围的护套来维持试纸的多层结构。在优选实施方式中，这种护套也可以用作施涂层。本发明的试纸还可包括载体层，其余层复合体施覆在该载体层上。这种载体层简化对试纸的操作，因为借此能够对试纸进行操作，而无需触碰包含部分敏感层的其余的层结构。本发明也涉及一种测试系统，其包括本发明的试纸以及用于检测信号S1和S2的检测器。所述检测器优选为光度计，特别优选为用电池运行的光度计。光度计概念也包含荧光测量仪。所述测试系统还可以包含计算单元，其用于根据检测的信号计算反应因数以及用于测定试样中的分析物的浓度。所述测试系统还可以包含输出单元，使用者能够借助这个输出单元读取分析物的浓度。在一或两个信号为电化学特性的另一本发明的应用中，所述检测器为电流表或者电压表，优选为电流表。所述检测器还可以配备用于信号增强的构件。所述测试系统还可以包含计算单元，其用于根据检测的信号计算反应因数以及用于测定试样中的分析物的浓度。所述测试系统还可以包含输出单元，使用者能够借助这个输出单元读取分析物的浓度。本发明也涉及将本发明的方法的用于测定试样中的分析物的含量的应用。本发明还涉及一种试剂盒，其适于实施本发明的方法。所述试剂盒包括至少一个酶配置品，以及至少一个信号产生底物的至少一个配置品。其中，所述酶配置品包括上述酶，且所述信号产生底物的配置品包括上述信号产生底物。所述酶配置品和或至少一个信号产生底物的至少一个配置品可以是固态配置品，例如冻干制剂或粉末，或者是液态配置品，例如溶液。液态配置品可以包括处于适合的缓冲剂或者去离子及或无菌水中的溶液。这些配置品和其他适合的配置品以及其制造已为本领域技术人员所知。所述试剂盒优选提供用于实施本发明的方法的指示。所述至少一个信号产生底物的至少一个配置品优选可以包含两个或两个以上不同的信号产生底物。这些不同的信号产生底物在酶反应中导致可区分的信号。所述试剂盒优选包括至少一个信号产生底物的两个配置品，其中所述配置品可以各自包含不同浓度的所述至少一个信号产生底物。其中，第一配置品中的信号产生底物的浓度优选可以至少为第二配置品中的信号产生底物的浓度的两倍。进一步优选地，所述试剂盒可以包括至少一个信号产生底物的两个配置品，其中这两个配置品中的信号产生底物不同。此外，所述试剂盒优选可以包括至少一个比色皿和或至少一个微量滴定板。可以借助常规实验室设备，如荧光光谱仪或者酶标仪来实施在使用所述试剂盒或执行本发明的方法的过程中待实施的测量。相应的测量法已为本领域技术人员所知。优选地，所述试剂盒以各自独立的容器提供所述配置品。所述容器优选可以封闭，特别是为可封闭的比色皿和或微量滴定板。实例下面结合若干实施例对本发明进行阐释。BAPNA纤维蛋白原围绕因胰蛋白酶引发的裂解的竞争在第一试验系列中，对BAPNAN-苯甲酰-D,L-精氨酸-对硝基苯胺和纤维蛋白原围绕因胰蛋白酶引发的裂解的竞争进行研究。BAPNA的因胰蛋白酶引发的裂解导致释放对硝基苯胺，进而导致405nm条件下的吸收增大。酶活性的影响首先改变酶活性，从而模拟测试存放期间的酶活性降低以及试样中所包含的因子对酶的抑制。在分析溶液的60μgml胰蛋白酶浓度下实施测量系列，而另一分析溶液中的胰蛋白酶浓度仅为40μgml。此外，对两个不同的BAPNA浓度0.2mM和2mM进行测试。在0mgml与4mgml之间，以1mgml、2mgml和3mgml的梯度改变纤维蛋白原浓度。在25℃下实施测量。随着纤维蛋白原浓度增大，测得的BAPNA反应的速度降低。在BAPNA浓度较低的情况下，这个效应相对较强。在饱和浓度下，独立于纤维蛋白原测量vmax。在信号产生底物和分析物的所有浓度下，酶浓度的增大导致反应速度的成比例提升。与此对应地，测试存放期间的酶活性降低或者试样引发的抑制通过有所降低的活性导致大幅高估的纤维蛋白原测定。这个结果显示，试样中的分析物浓度的酶动力学测定易受以下影响：测试存放期间的酶活性降低以及试样中所包含的因子对酶的抑制，故现有技术中的这种测试不适于以高精度测定纤维蛋白原浓度。测量波长的影响在40μgml的胰蛋白酶浓度下在上述条件下实施另一测量系列，区别在于，在425nm的波长，而非上述405nm的波长下进行测量。在这个波长偏差下测得显著降低的值，就结果而言这会导致对纤维蛋白原浓度的明显高估。温度的影响在40μgml的胰蛋白酶浓度下在上述条件下实施另一测量系列，区别在于，温度为29℃，而非上述的25℃。这个温度升高导致约20％的酶活性升高。这样一来，这种温度升高会错误地呈现更低的纤维蛋白原浓度。温度和酶活性对反应因数的影响以BAPNA和纤维蛋白原围绕因胰蛋白酶引发的反应的竞争为例可以看出，通过根据以信号产生底物的不同浓度进行的两个测量的信号计算反应因数，能够将酶浓度、测量波长和温度的较大差别所造成的影响消除。图1和图2以不同的底物浓度及酶浓度为例示出原理。如图2所示，底物浓度和酶浓度均对纤维蛋白原相关的反应速度造成影响。如果将高浓度下的反应速度除以低浓度下的反应速度，则获得仅还与纤维蛋白原浓度相关的反应因数图3。针对竞争性相互作用的理论阐释当分析物和信号产生底物与酶达到快速的竞争性预平衡，并且将底物的起始反应速度作为信号加以观察时，可以忽略分析物的反应。在此情形下，可将分析物作为抑制剂处理，并将已知的方程1用于竞争性阻碍。如果绘制标准化反应速度VVmax相对标准化浓度[S]KM对数尺度的曲线，则根据标准化分析物浓度[I]KI产生不同的曲线，其允许分析物浓度的微分。图4示出这一点。对于较高的底物浓度而言，优选选择如此高的底物浓度，使得近乎与分析物无关地达到vmax。在实例中，在[S]KM＝1000时极佳地实现这一点图4，右上方矩形。在有所减小的浓度例如50·KM下，起始速度值的变化相应增大，但仍总是获得可供用于计算反应因数的有用的参考值。在底物浓度较低的情况下，可以将分析物浓度的微分更多地向更高的值图4，中心矩形或向更低的值图4，左侧矩形移动。这样便获得非常高的反应因数图5，但需要考虑到的是，低浓度下的反应速度非常小且相应地难以测量。因此，优选采用介于1·KM与20·KM之间的低浓度。微分的品质也取决于标准化分析物浓度[I]KI。为了实现良好的微分，优选采用[I]≥KI。就许多酶而言，KI与诸如pH或离子强度的测试条件相关，可相应地进行优化。可以进行适当的试样稀释或者试样浓缩，或者最后以适当的KI研究酶或者以基因技术方式生成酶。有许多其他抑制类型，如非竞争性、混合型或者不可逆的类型。在某些情形下，这类表征也仅在抑制剂和底物的特定浓度范围内适用。就结合特性良好的抑制剂而言，可逆预平衡的条件也可能被抑制剂的过于缓慢的离解损害；在此情形下，竞争性结合产生非竞争性抑制J.斯图加特大学资格论文HabilitationsschriftStuttgart1985，第59-61页。因此需要强调的是，本发明的原理不局限于上述竞争性抑制的理论情形。当底物反应与分析物反应相互影响时，总是可以应用本发明的原理，而与以酶动力学方式测定的抑制的类型无关。在这类情形下，可以通过在低底物浓度和高底物浓度下相继进行两个测量来消除可变的酶活性。在此情形下，以反应因数相对分析物浓度的纯粹基于经验的校准曲线工作。凝血酶纤维蛋白原荧光测量实例将缓冲剂、底物和纤维蛋白原置于96孔微量滴定板中。通过附属于TECAN酶标仪的注射器将酶注入。试验条件参阅以下说明。移液图在通过摇晃进行短暂混合后，以5分钟为区间记录因底物裂解引发的荧光增强。将ΔImin值成对地相除，即12、34乃至1112。其中发现，在一个小时内，从区间1至11，酶活性从100％降低至15％。但在相互结算的值对之间仅有5分钟的时间差，在反应因数与纤维蛋白原浓度之间存在有意义的关联。亦即，在结算的区间之间的偏差较小的情况下，便能借助该方法对酶活性中的即便是较大的误差进行补偿。结果如图6所示。经稀释的酶的不稳定性基于在注射器的玻璃表面上的吸附。通过添加0.1％PEG6000和0.25MNaCl来将酶稳定化。就荧光测量而言，荧光强度与猝灭物质猝灭剂存在与否的关联通常是有害的。因为在本发明的实施方案中，在两个区间中对荧光团产生相同的影响，故通过结算对潜在的淬灭效应进行补偿。苯二胺的裂解光度和电化学检出凝血酶也使得Z-Gly-Pro-Arg-对苯二胺裂解。可以在存在铁氰化物III的情况下通过与α-萘酚的氧化偶联检出产物。产生λmax＝565nm的紫色色素。pH8缓冲器如同针对荧光测量+2％TritonX100条件下的米氏常数为6μM。作为替代方案，也可以对苯二胺进行电化学氧化，并将电流随时间的提升用作针对酶活性的尺度。在较高和较低的底物浓度下，能够如同荧光那样类似地测量纤维蛋白原。电化学测量反映至电极面的物质输送。这与浓度以及与扩散系数成比例。在生物样本材料中，这个特性非常多变，例如因大分子或者血细胞血细胞压积造成。因此，例如在针对血糖测试的应用中有大量附加测量，例如复阻抗，用以检测这些变化并对其进行修正。就本发明的方法而言，两个区间中的粘度和血细胞压积相同，并通过结算加以补偿。附图说明图1为针对[S2]＝KM和[S1]＝10*KM的函数U[I]的特性曲线。图2示出BAPNA的反应速度y轴随纤维蛋白原浓度x轴的变化。示出四个不同的测量系列，其中既改变信号产生底物的浓度，也改变酶的浓度。图3示出根据如图2所示数据计算出的反应因数与纤维蛋白原浓度的关联。示出两个不同的酶浓度下的反应因数以及据此测定的拟合直线。图4示出标准化反应速度VVmax随标准化浓度[S]KM对数尺度的变化。示出针对不同分析物浓度的关联。图5示出反应因数y轴与标准化分析物浓度[I]KI的关联。示出针对不同底物浓度的关联。图6示出反应因数y轴随纤维蛋白原浓度x轴的变化。数字1至6参照在移液图中示出的测量系列，其中图6中的“1”对应测量系列1和2的结算，“2”对应测量系列3和4的结算，“3”对应测量系列5和6的结算，“4”对应测量系列7和8的结算，“5”对应测量系列9和10的结算，且“6”对应测量系列11和12的结算。

权利要求：1.一种测定试样中的分析物的含量的方法，包括以下步骤：a.制备至少一个分析溶液，i.其中所述至少一个分析溶液包括酶、信号产生底物以及待分析试样的已知比例，以及ii.其中所述酶既能够使所述分析物、也能够使所述信号产生底物发生反应，故分析物与信号产生底物围绕因酶引发的反应发生竞争，b.对通过酶催化反应在所述至少一个分析溶液中产生的两个信号S1和S2进行检测，c.根据所述信号计算反应因数，以及d.借助所述反应因数测定试样中的分析物的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a中制备第一分析溶液A1和第二分析溶液A2。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度至少为所述第二分析溶液A2中的信号产生底物的浓度的两倍。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第一分析溶液A1中的信号产生底物的浓度至少为达到酶饱和所需浓度的80％。5.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中根据所述信号计算反应因数，具体方式为，根据信号测定所述信号产生底物的酶反应的起始速度v0S1和v0S2，并且将所述起始速度v0S1和v0S2相互结算。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述起始速度的结算包含求v0S1与v0S2的商。7.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述酶为凝血酶，以及，所述分析物为纤维蛋白原。8.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述信号a.在两个单独的分析溶液中通过所述信号产生底物的较高浓度的酶催化反应信号S1以及通过信号产生底物的较低浓度的酶催化反应信号S2产生，或者b.通过所述信号产生底物的酶催化反应信号S1以及通过所述分析物的酶催化反应信号S2产生，或者c.通过第一信号产生底物的酶催化反应信号S1以及通过第二信号产生底物的酶催化反应信号S2产生。9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中在比色皿和或微量滴定板中制备所述分析溶液。10.一种用于实施如上述权利要求中至少一项所述的方法的试纸，其中所述试纸包括至少一个含有所述酶的酶层以及至少一个含有所述信号产生底物的底物层。11.一种测试系统，包括如权利要求9所述的试纸以及用于检测所述信号S1和S2的检测器。12.一种用于实施如权利要求1至9中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个酶配置品和至少一个信号产生底物的至少一个配置品。13.根据权利要求12所述的试剂盒，还包括用于实施如权利要求1至9中任一项所述的方法的指示。14.根据权利要求12或13中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一个信号产生底物的两个配置品，其中所述配置品各自包含浓度不同的所述至少一个信号产生底物。15.根据权利要求12或13中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个信号产生底物的两个配置品，其中所述两个配置品中的信号产生底物不同。16.根据权利要求12或13中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一个配置品包含至少两个不同的信号产生底物。17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述第一配置品中的信号产生底物的浓度至少为所述第二配置品中的信号产生底物的浓度的两倍。18.根据权利要求12至17中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括至少一个比色皿和或至少一个微量滴定板。19.根据权利要求12至18中任一项所述的试剂盒，其中所述酶配置品和所述至少一个信号产生底物的配置品是以各自独立的容器提供。

百度查询： 达姆施塔特技术大学 带有内部酶活性补偿的酶底物的竞争性测试

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