申请/专利权人：中国医学科学院北京协和医院

申请日：2022-05-10

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN114958750B

主分类号：C12N5/09

分类号：C12N5/09;C12N5/071

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.30#授权;2022.09.16#实质审查的生效;2022.08.30#公开

摘要：一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，包括如下步骤：1将胰腺癌组织剪切后，进行酶解消化，得到富含组织外泌体的酶解消化液；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；2将酶解消化液通过尺寸排组色谱法提取外泌体。本发明的方法最大程度地维持外泌体的完整性与得率；不依赖于大型仪器设备，在节约时间与经费的同时可获得高纯度的外泌体。

主权项：1.一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将胰腺癌组织剪切后，进行酶解消化，得到富含组织外泌体的酶解消化液；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；（2）将酶解消化液通过尺寸排组色谱法提取外泌体；酶解消化的方法为：①向EP管加入RPMI1640培养基、胶原酶D储存液和DNA酶1储存液；然后将EP管水平放置于摇床，进行酶解消化；②完成酶解消化后，将EP管进行在2000g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间15±1min；所得上清液即为去除组织块的富含组织外泌体的酶解消化液；剪切样品的质量为0.2±0.01g；RPMI1640培养基的加入量为1ml；胶原酶D（CollagenaseD）储存液的加入量为20µl；DNA酶1（DNase1）储存液的加入量为4µl；胶原酶D储存液的浓度为50～150mgml，DNA酶1储存液的浓度为10000～30000Uml；步骤（2）中尺寸排组色谱法提取外泌体的方法为：（Ⅰ）将酶解消化液进行在16500g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间20±1min，获得二次上清液；（Ⅱ）将二次上清液经0.22µm滤器过滤后，获得的滤液加入尺寸排阻色谱柱；所述尺寸排阻色谱柱用10ml琼脂糖凝胶CL-6B填充；（Ⅲ）当滤液完全进入尺寸排阻色谱柱后，加入PBS；其中PBS分成6～8次加入；前1～3次加入PBS后生成的馏分流空，后续5次加入PBS后生成的馏分全部收集，得到外泌体悬液；步骤（Ⅲ）中，每次PBS的加入量为500μl～1ml；外泌体悬液的收集量为每次PBS的加入量的5倍；步骤（Ⅲ）中，将外泌体悬液加入超滤离心管，在3800g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间5±1min，离心至固相为外泌体悬液总量的8～15%，获得的固相为浓缩胰腺癌组织外泌体悬液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国医学科学院北京协和医院 一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法

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