申请/专利权人：银丰基因科技有限公司;银丰生物工程集团有限公司

申请日：2023-07-07

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN117025766B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.30#授权;2023.11.28#实质审查的生效;2023.11.10#公开

摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类ALK‑E13；A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用。本发明所制备的DNA标准品具体为：ALKE13‑A20‑1％ALKE13‑A20‑2％ALKE13‑A20‑5％。本发明制备的人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品，产品标准品准确度高、均匀度良好。本发明首次建立了人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品；本发明中ALKE13；A20融合基因突变检测定量标准品，量值准确，适用性好。可用于数字PCR或其他方法的验证和性能评估。

主权项：1.一种人类ALK（E13-A20）融合基因突变检测用DNA标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取含有ALK（E13-A20）融合基因的NCIH3122细胞系gDNA以及HEK293野生型细胞系gDNA作为模板，通过Sanger测序对ALK（E13-A20）基因融合位点和野生型细胞系gDNA进行测序验证；（2）对EML4-AKL融合位置碱基序列进行分析，设计引物探针；（3）采用数字PCR的方法对NCIH3122细胞系gDNA和HEK293野生型细胞系gDNA的ALK（E13-A20）融合基因突变频率进行测定，分别重复3次，取3次测定的平均值，作为NCIH3122细胞系的突变频率；（4）按照不同比例将NCIH3122细胞系gDNA和HEK293野生型细胞系gDNA进行混合，分别获得1%、2%和5%突变频率的ALK（E13-A20）融合基因DNA标准品，采用数字PCR法进行基因突变频率验证，以及进行标准品均匀性验证；所述ALK（E13-A20）融合基因的序列为：TGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTC；所述NCIH3122细胞系gDNA的ALK（E13-A20）融合基因序列为：ATATAAATGGAGTCATACAATGTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTCTAAGTATGATGGAAAGGTTCAGAGCTCAGGGGAGGATAT；所述HEK293野生型细胞系gDNA的EML4基因序列为：GTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGATTTCGGCTCACTGAACCTCCGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTC；所述DNA标准品测定用引物探针组为：检测位点上游引物：5’TTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTG3’检测位点下游引物：5’AAGGTGTGTCTTTAATTGAAGCATG3’检测位点探针-FAM：5’AGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATT3’-BHQ1内参上游引物：5’AACCACCAGAACATTGTTCGC3’内参下游引物：5’GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA3’内参探针-VIC：5’GCATTGGGGTGAGCCTGCAAT3’-BHQ1；所述数字PCR的扩增体系为： 所述数字PCR的扩增条件为：95℃，3min；40个循环包括95℃，30s，60℃，90s；98℃，5min。

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