申请/专利权人：江苏省农业科学院

申请日：2017-12-29

公开（公告）日：2018-04-10

公开（公告）号：CN107893080A

主分类号：C12N15/113(2010.01)I

分类号：C12N15/113(2010.01)I;C12N15/90(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.05.11#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.05.04#实质审查的生效;2018.04.10#公开

摘要：本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向识别大鼠Inhba基因的sgRNA及其应用。公开了一种靶向Inhba基因的sgRNA以及利用CRISPR‑Cas9系统编辑大鼠Inhba基因的方法。本发明提供的sgRNA能特异的靶向大鼠Inhba基因，并且能够以25％的效率对Inhba基因进行编辑，为进一步研究大鼠Inhba基因在其卵泡发育中的功能提供了基础。

主权项：一种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA命名为sgRNA‑2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

全文数据：一种靶向大鼠Inhba基因的SgRNA及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向识别大鼠Inhba基因的SgRNA及其应用。背景技术[0002]对基因的靶向性编辑是研究基因功能的重要手段。传统的同源重组介导的基因打靶技术在研究基因的功能上发挥了重要作用，但是存在着极低的打靶效率、复杂的载体构建以及冗长的细胞筛选等缺点（VasquezKM，MarburgerK，IntodyZ,WilsonJH.Manipulatingthemammaliangenomebyhomologousrecombination.ProcNatlAcadSciUSA.2001Jul17;9815:8403-10.，已严重阻碍了目前对高通量及高效靶向基因编辑的需求。近年来以ZFN和TALEN为代表的人工核酸酶在基因的靶向性编辑中得到了迅速发展，它们通过以一个结合域识别特定DNA位点以及另一个内切酶结构域切割DNA的方式能方便的对基因位点进行编辑，其效率与传统的基因打靶相比得到了大幅度提高GajTjGersbachCAjBarbasCF3rd.ZFNjTALENjandCRISPRCas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsinBiotechnology.2013Jul;317:397_405·，然而ZFN和TALEN的构建程序仍十分繁琐，限制了它们的广泛应用。[0003]CRISPRCas9系统是细菌和古细菌为抵抗外源病毒入侵所进化的一种适应性免疫防御系统（HorvathP,BarrangouR.CRISPRCas，theImmuneSystemofBacteriaandArchaea.Science.2010Jan8;3275962:167-70。它通过一小段RNAsgRNA与DNA识别并借助Cas9核酸酶可以高效精确的对基因进行革巴向编辑JinekM，ChylinskiK，FonfaraI,HauerMjDoudnaJA,CharpentierE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science.2012Aug17；3376096:816-21.。研究表明在高等生物例如人、动植物中也存在CRISPRCas9系统，并且已经利用CRISPRCas9系统对人、小鼠、植物的基因都进行了有效的编辑（HsuPD，ScottDA，WeinsteinJA,RanFA,KonermannS,AgarwalaV,LiYjFineEJjWuXjShalemO,CradickTJ，MarraffiniLA，BaoG，ZhangF·DNAtargetingspecificityofRNA-guidedCas9nucleases.NatBiotechnol.2013Sep；319:827~32；[0004]WuYjLiangDjWangYjBaiMjTangffjBaoSjYanZjLiDjLiJ.CorrectionofageneticdiseaseinmouseviauseofCRISPR-Cas9.CellStemCell.2013Dec5；136:659-62；[0005]ĵiangW，ZhouH，BiHiRrommM，YangB，WeeksDP.DemonstrationofCRISPRCas9sgRNA-mediatedtargetedgenemodificationinArabidopsis,tobacco,sorghumandrice.NucleicAcidsRes.2013Nov;4120:6188。此外通过改造Cas9核酸酶，该系统可大幅度的提高靶向特异性，使脱靶编辑降低到无法检测到的水平SlaymakerIM，GaoL，ZetscheB，ScottDAjYanWXjZhangF.RationallyengineeredCas9nucleaseswithimprovedspecificity.Science.2016Jan1;3516268:84_8D该系统的使用极为简便，不像ZFN和TALEN那样构建繁琐，已经成为一项热门的基因编辑技术，被广泛应用于医学以及动植物育种等领域。[0006]Inhba基因是构成TGF-β超家族成员之一ActiVinA的亚基单位，其在动物卵泡的发育中具有重要作用。因而，在细胞或个体水平上对大鼠Inhba基因进行敲除或编辑，可为进一步解析大鼠卵泡发育的分子机理提供基础。发明内容[0007]技术问题[0008]本发明的目的在于提供一种靶向大鼠Inhba基因的SgRNA以及利用CRISPR-Cas9系统编辑大鼠Inhba基因的方法。[0009]技术方案[0010]—种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA，其特征在于，所述SgRNA命名为sgRNA-2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；[0011]所述的sgRNA-2在大鼠Inhba基因上位于其第二外显子的反义链上。所述的SgRNA-2其靶标序列特征符合5’-N20NGG-3’的排列规则，其中N20表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G。[0012]所述一种靶向大鼠Inhba基因SgRNA可以利用细胞本身的CRISPR-Cas9系统在细胞水平上对大鼠Inhba基因进行有效的切割编辑或敲除应用。具体为：[0013]1根据SgRNA-2序列SEQIDNO.1通过金斯瑞生物科技有限公司合成相应的单链寡核苷酸，具体序列如下：[0014][0015][0016]用TEbuffer将Inhba-F与Inhba-R单链寡核苷酸稀释成IOpmolμΐ，各取10μ1加入至IjO.2mlEP管中，然后95°C6min后，室温自然冷却退火互补；同时用Bbs頂每切ρΧ330载体后进行回收纯化，将退火互补的sgRNA-2与上述酶切回收的pX330载体连接得到pX330-Inbha-sgRNA-2载体；[0017]2pX330-Inbha-sgRNA-2对大鼠Inbha基因的切割编辑[0018]将pX330-Inbha-sgRNA-2载体转染L6细胞72h后，提取DNA，用上游引物Fl与下游引物Rl组成的引物对提取的DNA进行PCR扩增（Fl:5’gacttttgctgccaggatgc3’；Rl:5’cgccaccatcaccacctaat3’）；PCR扩增Inhba基因革巴标序列，回收纯化；[0019]将扩增转染pX330-Inbha-sgRNA-2的Inhba基因的Inhba基因靶标序列回收纯化产物与pEASY-BluntsimpleCloningkit载体进行连接，将此5μ1连接产物转化到Trans5a的感受态细胞中，通过T7E1酶切和克隆测序，得出重组pX330-Inbha-sgRNA-2载体利用细胞本身的CRISPR-Cas9系统在细胞水平上对Inhba基因的切割效果。[0020]有益效果[0021]本发明公开了一种靶向Inhba基因的SgRNA及其用于CRISPR-Cas9系统编辑大鼠Inhba基因的方法。该SgRNA位于大鼠Inhba基因第二外显子的反义链，其靶标序列特征符合5’-N20NGG-3’的排列规则，其中N20表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G。所述的SgRNA能通过CRISPR-Cas9系统在细胞水平上对大鼠Inhba基因进行有效的编辑或敲除，并且该sgRNA序列位点没有Off-targets所述的O，I，2，3错配类型，因而在全基因组水平上是特异识别Inhba基因座的。[0022]本发明提供的SgRNA能特异的靶向大鼠Inhba基因，并且能够以25%的效率对Inhba基因进行编辑，相比同源打靶效率〈1%有极大的提高。同时该方法相比同源打靶、ZFN和TALEN而言操作简单，不需要构建复杂的载体，为进一步研究大鼠Inhba基因在其卵泡发育中的功能提供了基础。附图说明[0023]图1为大鼠Inhba基因结构，含有三个外显子。[0024]图2sgRNA-l在其第二外显子编码序列（SEQIDNO2上的靶标位点示意图，其中下划线代表sgRNA-1位点，下虚线代表PAM位点。[0025]图3sgRNA-2在其第二外显子编码序列（SEQIDNO2上的靶标位点示意图，其中下划线代表sgRNA-2位点，下虚线代表PAM位点。[0026]图4sgRNA-3在其第三外显子编码序列（SEQIDNO3上的靶标位点示意图，其中下划线代表sgRNA-3位点，下虚线代表PAM位点。[0027]图5为pX330-Inbha-sgRNA-l载体转染大鼠肌细胞L672h，提取细胞DNA并扩增Inhba基因靶标序列的PCR产物经过T7E1酶切割的电泳图。[0028]Mmarker，大小从下往上100,250,500,750，1000,2000kb[0029]1转染pX330载体阴性对照）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0030]2转染pX330-Inbha-sgRNA-l载体实验组的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0031]图6为pX330-Inbha-sgRNA-2载体转染大鼠肌细胞L672h，提取细胞DNA并扩增Inhba基因靶标序列的PCR产物经过T7E1酶切割的电泳图。[0032]Mmarker，大小从下往上100,250,500,750，1000,2000kb[0033]1转染pX330载体阴性对照）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0034]2转染pX330-Inbha-sgRNA-2载体实验组的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0035]图7为pX330-Inbha-sgRNA-3载体转染大鼠肌细胞L672h，提取细胞DNA并扩增Inhba基因靶标序列的PCR产物经过T7E1酶切割的电泳图。[0036]Mmarker，大小从下往上100,250,500,750，1000,2000kb[0037]1转染pX330载体阴性对照）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0038]2转染pX330-Inbha-sgRNA-3载体实验组的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切[0039]图8pX330-Inbha-sgRNA-2载体转染大鼠肌细胞L672h，提取细胞DNA并扩增Inhba基因革E标序列的PCR广物进彳丁克隆测序后有突变位点的结果具体实施方式[0040]本发明采用的技术方案如下：1利用在线网站设计及选择大鼠Inbha基因的SgRNA靶标位点序列，合成相应的寡核苷酸，然后退火互补；同时用BbsI酶切pX330载体后进行回收纯化，将退火互补的sgRNA与上述酶切回收的pX330载体连接得到pX33〇-Inbha_sgRNA载体;2将pX330-Inbha-sgRNA载体转染L6细胞72h后，通过T7E1酶切和克隆测序两个方面来评价该sgRNA对大鼠Inhba基因的编辑效率。[0041]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。[0042]一pX33〇-Inbha_sgRNA载体的构建[0043]1、大鼠Inbha基因的SgRNA靶标位点设计[0044]在NCBI登录号为NM_017128的序列中提取大鼠Inhba基因mRNA序列的编码区，其核苷酸序列如SEQIDNO4所示。使用在线软件（http:chopchop.cbu.uib.noMontagueTG1CruzJM1GagnonJA1ChurchGM1ValenE.CH0PCH0P:aCRISPRCas9andTALENwebtoolforgenomeediting.NucleicAcidsRes.2014Jul；42WebServerissue:W401-7设计sgRNA靶标位点。大鼠Inhba基因一共有三个外显子，第一外显子长度只有57bp而且又不属于该基因的编码区，因此不考虑第一外显子。分别在Inhba的第二和第三外显子上设计sgRNA祀标位点。首先考虑〇ff-targets指标，确保sgRNA序列位点没有Off-targets所述的0，1，2，3错配类型，以使针对Inhba基因的sgRNA靶标位点在基因组上高度特异;然后考虑Self-complementarity，选择数值为0的sgRNA位点，以防止其自身互补，阻碍其与祀标位点的结合;最后综合G含量（40%-60%和Efficiency50%效率筛选三对sgRNA序列:其中sgRNA-Ι和sgRNA-2位于Inhba基因的第二外显子，sgRNA-3位于Inhba基因的第三外显子，三对sgRNA序列如下：:根据sgRNA序列通过金斯瑞生物科技有限公司合成相应的单链寡核苷酸，具体序列如下：[0048]针对sgRNA-Ι合成的单链寡核苷酸：[0051]针对sgRNA-2合成的单链寡核苷酸：[0054]针对sgRNA-3合成的单链寡核苷酸：[0057]用TEbuffer将Inhba-F与Inhba-R单链寡核苷酸稀释成lOpmolμΙ，各取10μ1加入到0.2mlEP管中，然后95°C6min后，室温自然冷却。[0058]2、pX330载体的酶切与回收纯化[0059]酶切体系：4ygpX330载体Addgene，货号：42335，5μ110XCutSmartBuffer，4yIBbsI酶NEB公司，货号R0539S，加入灭菌水补足体积至50μ1，37Γ孵育3h，然后将酶切产物在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出约Skb大小的DNA条带，用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化DNAΖΥΜ0，货号:D4007。具体步骤如下：将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml尚心官中，称重后加入3彳首体积的ADBbuffer，55C保温10min，待琼脂糖凝I父完全融化后将其转入附柱中，IOOOOg离心30s，倒掉流出液;加入200μ1washbuffer，10000g离心30s，倒掉流出液;重复一次;最后将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入10μ1ddH20,放置Imin，IOOOOg离心30s收集纯化产物。[0060]3、Inbha-SgRNA序列与PX330载体的连接、克隆与测序[0061]取步骤1中室温冷却的0.2mlEP管中的2μ1产物，ΙμΐpX330酶切回收产物，2μ1灭菌水，5μ1solution1〇^1«^3，货号：6013，混匀，16°：111。将此1^1连接产物转化到Trans5a的感受态细胞中，步骤如下：取一管的Trans5a感受态细胞（北京全式金货号：CD201-01置于冰上7min，向其中加入10μ1上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min;42°C热激45s，后冰上静置2min;加入900μ1无抗性的LB液体培养基，37°C200rpm震荡培养Ih;用移液器吸取200μ1菌液涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上。然后将平板倒置于37°C温箱培养12h。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至Iml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°：震荡培养12h，随机挑选5个克隆送去测序金斯瑞生物科技有限公司进一步确定阳性克隆的正确性测序引物序列：ggactatcatatgcttaccg，即得到pX33〇-Inbha_sgRNA载体。[0062]二pX330-Inbha_sgRNA对大鼠Inbha基因的切割验证[0063]l、pX330-Inbha-sgRNA转染L6细胞（国家实验细胞资源共享服务平台（北京总部）购买）[0064]转染前一天将L6细胞铺到6孔板中，置于培养箱37°C，5%C02条件下培养。[0065]转染当天将重组载pX330-Inbha-sgRNA-l，pX330-Inbha-sgRNA-2，pX330-Inbha-sgRNA-3实验组）分别和pX330载体（阴性对照组）通过脂质体Lip〇nxlamine®3000Invitrogen，货号：L3000150转染L6细胞。转染的具体步骤是:在一个1.5mlEP管中加入125μ1opti-MEM，然后加入3·75μ]Lipoi'ec丨.amine®3000，混匀；在另一个1·5mlEP管中加入125μ1opti-MEM，2.5ygpX330-Inbha-sgRNA载体，5μ1P3000™，混匀；将两个1.5mlEP管中的溶液混在一起，室温放置5min后，滴加到板孔中，然后置于培养箱37°C，5%C02条件下培养。[0066]2、转染L6细胞72h后DNA的提取[0067]转染24h后，换新鲜全培养基，继续培养48h后收集细胞。然后用DNA提取试剂盒提取细胞DNATakara，货号:9765，具体步骤是：向细胞沉淀中加入180μ1的BufferGL、20μ1的ProteinaseK和10μ1的RNaseA10mgml，于56°C水浴IOmin;然后向裂解液中加入200μ1100%乙醇，充分吸打混勾；将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2min，弃滤液；将500μ1的BufferWA加入至SpinColumn中，12，OOOrpm离心lmin，弃滤液；将700μ1的BufferWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心lmin，弃滤液；将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2min;将SpinColumn安置于新的I·5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50μ1的EIutionBuffer，室温静置5min;12，OOOrpm离心2min洗脱DNA。[0068]3、Inhba基因靶标序列的PCR扩增[0069]以步骤2提取的细胞DNA并作为模板，针对SgRNA-I和sgRNA-2,用上游引物Fl与下游引物Rl组成的引物对提取的DNA进行PCR扩增Fl:5’gacttttgctgccaggatgc3’；R1:5’cgccaccatcaccacctaat3’）；回收536bp的PCR扩增产物。针对sgRNA-3,用上游引物F2与下游引物R2组成的引物对提取的DNA进行PCR扩增F2:5’tgctcctgggcaagaagaag3’；R2:5’gacctggcaactctaggagc3’）；回收524bp的PCR扩增产物。PCR反应体系如下：25μ1PrimerSTARMaxDNAPolymeraseTaKaRa，货号：R045A，50ngDNA，上游引物F0.3uM，下游引物R0.3uM，加超纯水至50μ1ACR反应程序95°C预变性2min，1个循环；98°C10s，60°C15s，72°C15s，30个循环;72°C后延伸SmiruPCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化ZYMO,货号:D4007，具体步骤同上。[0070]4Inhba基因靶标序列PCR产物的酶切[0071]利用T7E1NEB，货号:M0263S将步骤3得到的PCR回收纯化产物先进行PCR梯度变性，然后再进行酶切。PCR梯度变性程序:200ngPCR回收产物，1.ΙμΐT7ElbufTer，灭菌水补齐到10.5μ1，然后进行PCR梯度变性，程序为:95°C变性5min;95-85°C，每秒降低2°C;85-25°C，每秒降低0.1°C。酶切反应体系如下：10.5μ1上述产物，0.5μ1T7E1，37°C30min，然后在2%的琼脂糖进行电泳，由图5和图7可以看到转染pX330载体组（阴性对照）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切后没有出现条带与预期相符，而转染pX330-Inbha-sgRNA-l和pX330-Inbha-sgRNA-3实验组）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切后也未出现预期的切割条带，表明经过软件选中的两条sgRNA-1和sgRNA-3无效。而由图6可以看到转染pX330载体组（阴性对照）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切后没有出现条带与预期相符，转染pX330-Inbha-sgRNA-2实验组）的Inhba基因靶标序列经过T7E1酶切后，536bp的产物被切割为大约386bp和150bp，出现预期的切割条带，表明sgRNA-2有效。[0072]5Inhba基因靶标序列PCR产物的克隆测序切割编辑效果）[0073]将扩增转染pX330-Inbha-sgRNA_2实验组）的Inhba基因的PCR回收纯化产物与pEASY-BluntsimpleCloningkit载体北京全式金，货号:CBl11-01进行连接，步骤为在0.2mlEP管中加入IylpEASY-Blunt载体，PCR产物4μ1，25Γ反应lOmin。将此5μ1连接产物转化到Trans5a的感受态细胞中，步骤同上。随机挑选20个克隆送去测序金斯瑞生物科技有限公司），计算有序列突变的克隆数占总体克隆数的比例，从而估算pX330-Inhba-sgRNA-2载体对Inhba基因的切割效率。结果发现5个克隆在预期切割位点附近出现突变（图8，即重组pX330-Inbha-sgRNA-2载体利用细胞本身的CRISPR-Cas9系统在细胞水平上对Inhba基因的切割效率为25%。

权利要求：1.一种靶向大鼠Inhba基因的SgRNA，其特征在于，所述SgRNA命名为sgRNA-2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种革El向大鼠Inhba基因的SgRNA，其特征在于，所述的SgRNA-2在大鼠Inhba基因上位于其第二外显子的反义链上。3.根据权利要求1或2所述的一种靶向大鼠Inhba基因的SgRNA，其特征在于，所述的sgRNA-2其靶标序列特征符合5’-N20NGG-3’的排列规则，其中N20表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G。4.权利要求1-3之一所述一种靶向大鼠Inhba基因SgRNA的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是指所述的SgRNA通过CRISPR-Cas9系统在细胞水平上对大鼠Inhba基因进行有效的编辑或敲除应用。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，1根据sgRNA-2序列SEQIDNO.1通过金斯瑞生物科技有限公司合成相应的单链寡核苷酸，具体序列如下：Inhba_F2:caccggcaaaggtgatgatctccgInhba-R2：aaaccggagatcatcacctttgcc用TEbuffer将Inhba-F与Inhba-R单链寡核苷酸稀释成IOpmo1μΐ，各取1Ομί加入到0.2mlEP管中，然后95°C6min后，室温自然冷却退火互补；同时用BbsI酶切ρΧ330载体后进行回收纯化，将退火互补的sgRNA-2与上述酶切回收的pX330载体连接得到pX330-Inbha-sgRNA-2载体；2pX330-Inbha-sgRNA-2对大鼠Inbha基因的切割将pX330-Inbha-sgRNA-2载体转染L6细胞72h后，提取DNA，用上游引物Fl与下游引物Rl组成的引物对提取的DNA进行PCR扩增，PCR扩增Inhba基因靶标序列，回收纯化；Fl:5'gacttttgctgccaggatgc3’；Rl:5'cgccaccatcaccacctaat3'；将扩增转染pX330-Inbha-sgRNA-2的Inhba基因靶标序列回收纯化产物与pEASY-BluntsimpleCloningkit载体进行连接，将此5ul连接产物转化到Trans5a的感受态细胞中，通过T7E1酶切和克隆测序，得出重组pX330-Inbha-sgRNA-2载体对Inhba基因的切割效果。

百度查询： 江苏省农业科学院 一种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD