申请/专利权人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所

申请日：2016-07-05

公开（公告）日：2016-12-07

公开（公告）号：CN106191231A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：["2016.01.15 CN 201610028540X"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.11.01#授权;2017.01.04#实质审查的生效;2016.12.07#公开

摘要：本发明提供了一种与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl‑4紧密连锁的分子标记BCYM000140，其特征在于：所述分子标记BCYM000140的上下游引物具有如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了基于所述分子标记的用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl‑4的结球甘蓝种质资源的试剂盒和方法。本发明所述的标记或试剂盒，具有特异性好、准确性高的特点，能在植株生长早期简捷快速地获知所测材料是否含有无蜡粉亮绿基因cgl‑4，以便于更有针对性地开展后续育种工作。

主权项：一种与结球甘蓝Brassica oleracea L.var.capitata L.var.capitata L.无蜡粉亮绿基因cgl‑4紧密连锁的分子标记BCYM000140的引物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：BCYM000140‑FBCYM000140‑R:CCCACTTCACTCTGCTTATGGTATGGTCGAAGTGGTATGC所述引物扩增的与结球甘蓝Brassica oleracea L.var.capitata L.无蜡粉亮绿基因cgl‑4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述引物扩增的与结球甘蓝Brassica oleracea L.var.capitata L.有蜡粉基因CGl‑4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

全文数据：与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用。背景技术结球甘蓝Brassicaoleraceavar.capitataL.属十字花科芸薹属，具有营养物质含量丰富、适应性广、易栽培、耐运输等特点，在我国蔬菜周年供应以及出口创汇中占有重要的地位，我国年栽培面积约90万hm2方智远，2008；杨丽梅等，2011。球色绿是结球甘蓝一项十分重要的商品性状，也是育种工作者的主要育种目标之一。由于结球甘蓝植株体表白色蜡粉的覆盖，结球甘蓝叶片一般表现为灰绿色或深绿色。植物体表蜡粉的合成和运输由多个基因控制，蜡粉合成基因的突变，会造成蜡粉合成通路中断和蜡粉的缺失，并最终导致叶色变成亮绿色或翠绿色。与野生型结球甘蓝相比，无蜡粉亮绿结球甘蓝具有质地脆嫩、VC等营养物质含量丰富的特点，表现出较好的商品性初莲香，1992。因此，无蜡粉亮绿突变体种质资源对选育商品性状美观、营养品质优良的结球甘蓝新品种具有十分重要的意义。由于无蜡粉亮绿基因cgl-4是单基因隐性遗传基因刘东明，2014，所以用于配备无蜡粉亮绿结球甘蓝品种的双亲必需同时含有cgl-4基因。因为目前只搜集到一份具有突变基因cgl-4的结球甘蓝材料LD10，所以需要通过以LD10与其它亲本材料杂交、多代回交的方式将突变基因cgl-4引入到其它亲本，从而获得另一份含有cgl-4基因的亲本材料。由于cgl-4基因符合单基因隐性遗传规律，在突变体LD10与其它有蜡粉结球甘蓝杂交、回交得到的后代材料中，杂合子和纯合子类型材料体表均有蜡粉覆盖，无法直接通过外观性状判断其是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，需通过对其进行自交、测交等方式鉴定其基因型。这不仅加大了工作量，而且延缓了育种进程。DNA分子标记辅助育种技术可以在分子水平上利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，不受周围环境和时间的影响，减少工作量，加速育种进程。因此与cgl-4紧密连锁的分子标记的获得和利用将会对后代选择提供极大的辅助作用。虽然刘东明等2014已经对无蜡粉基因cgl-4的分子标记进行了研究，获得了一个与无蜡粉性状控制基因连锁的分子标记，但此标记与结球甘蓝无蜡粉基因cgl-4间的遗传距离较远，为4.7cM，连锁关系不紧密，在选择育种工作中易出现后代筛选错误、选择效率低下的问题，无法应用于实际辅助选择工作。因此开发与无蜡粉性状基因cgl-4连锁更加紧密、能实际应用于辅助育种的分子标记十分必要。发明内容基于上述领域的不足和需求，本发明提供了一个用于筛选结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的PCR标记，该分子标记需具有特异性强、稳定性好的特点。本发明的技术方案如下：一种与结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140的引物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：BCYM000140-FBCYM000140-R:CCCACTTCACTCTGCTTATGGTATGGTCGAAGTGGTATGC所述引物扩增的与结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述引物扩增的与结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的试剂盒，其特征在于，包括所述的分子标记BCYM000140的引物。所述试剂盒还包括进行PCR反应和或电泳所需的试剂。用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的方法，其特征在于，采用所述的分子标记BCYM000140的引物或所述的试剂盒进行如下步骤：1采用所述分子标记BCYM000140的引物对待选结球甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；2对扩增结果进行凝胶电泳检测；3从电泳检测结果中筛选出与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带一致的材料，所述与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。所述PCR扩增的反应体系为：15mmolLMgCl2的10×Buffer0.1μLμL，含A、G、C、T各2.5mmolL的dNTP0.08μLμL，上下游引物各0.33μmolμL，Taq酶0.05UμL，模板DNA4ngμL，其余为双蒸水。所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s为1个循环，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。所述凝胶电泳检测指采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述分子标记BCYM000140的引物。组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和或电泳所需的试剂。本发明基于发明人的前期研究，利用结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10和有蜡粉野生型材料21-3配制F1，F1植株自交获得F2代群体，共898个单株，鉴定每个单株的蜡粉有无情况，结果为有蜡粉单株667个，无蜡粉单株231个。经过引物开发、筛选、验证，最终获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140。初步筛选：利用双亲LD10和21-3为模板，对本课题组现有的978对EST-SSR引物、2170对gSSR引物和255对Indel引物进行初步筛选，从中筛选出在双亲间存在多态性、条带清楚、易于识别、并可以稳定扩增的248对引物。二次筛选：根据基于性状表现的分离群体分组分析法BSA原理，在F2群体中随机选取10株无蜡粉亮绿单株和10株有蜡粉单株构建无蜡粉亮绿基因池和有蜡粉基因池，以无蜡粉亮绿基因池、有蜡粉基因池为模板对上述初步筛选出的多态性引物进行再次筛选，获得可能与目标基因连锁的DNA引物1个。对该引物和F2群体单株有无蜡粉性状的连锁关系进行验证，确定该引物与无蜡粉基因cgl-4紧密连锁。开发标记：基于上述标记和结球甘蓝基因组数据库的信息，在该标记附近区域开发了50对引物。验证：用F2分离群体单株对新开发的引物进行验证和分析，最终筛选获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4连锁关系最紧密的分子标记BCYM000140。本发明提供的与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140，其特征在于：所述分子标记BCYM000140的上下游引物的核苷酸序列分别如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示；所述分子标记BCYM000140的特异性引物扩增的与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述分子标记BCYM000140的特异性引物扩增的与结球甘蓝有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示，因此，采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增结球甘蓝基因组DNA。本发明所述标记BCYM000140与发明人2014年得到的分子标记相比，与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的遗传距离更近，遗传距离为0.28cM，连锁关系更为紧密，可实际应用于育种辅助选择。基于所述分子标记BCYM000140，本发明还提供了一种用于筛选包含无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的试剂盒。所述试剂盒的特征是，包括具有如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示的核苷酸序列的所述分子标记BCYM000140的引物；进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应和或电泳所需的试剂。采用所述引物，以结球甘蓝基因组DNA为模板，采用常规试剂进行常规PCR反应与电泳即可获知所测基因组DNA对应的结球甘蓝材料是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，简单快捷，采用最少的步骤能最快地获得结果。本发明还请求保护所述试剂盒的制备方法，任何规模的基于商业目的销售或生产所述试剂盒的行为都属于本发明请求保护的范围，其中生产所述试剂盒的行为指组装试剂盒的试剂中包括具有如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示的核苷酸序列的引物。本发明还请求保护采用所述分子标记BCYM000140或所述试剂盒进行包含无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源筛选的方法，即采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增待测结球甘蓝材料的基因组DNA，通过常规的PCR反应和电泳检测确定出符合育种条件的含有cgl-4基因的结球甘蓝育种材料。采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增结球甘蓝基因组DNA，可能出现三种电泳结果：仅出现131bp特征条带，说明DNA模板对应的结球甘蓝材料是含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的隐性纯和材料；仅出现135bp特征条带，说明DNA模板对应的结球甘蓝材料是包含有蜡粉基因CGl-4的显性纯和材料；同时出现131bp和135bp两种条带，说明是含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的有蜡粉显性纯和材料。选出第1、3种条带对应的结球甘蓝材料用作育种材料，剔除第2种条带结果对应的材料。由此可见，采用所述分子标记BCYM000140，可以在结球甘蓝生长周期的任一阶段获知该结球甘蓝是否包含cgl-4基因，从而筛选出符合育种条件的结球甘蓝材料。采用本发明所述的分子标记BCYM000140对含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源进行筛选，具有限制少、较准确、效率高等特点。更重要的是，采用本发明所述的标记或试剂盒，可在结球甘蓝生长早期通过提取秧苗DNA进行PCR扩增，能简捷快速地获知该结球甘蓝秧苗是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，并筛选出符合条件的秧苗，对于不符合条件的秧苗可以停止进一步继续培养，使结球甘蓝培育工作更有针对性，从而避免了产生多余劳动和资源浪费。综上所述，本发明所述的分子标记BCYM000140或试剂盒以及基于它们的筛选方法，克服了常规育种方法所需时间周期长、工作量大等缺点，大大加速了育种进程、减少了工作量。因此，本发明结果在结球甘蓝育种实践中大大提高了育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。附图说明图1为无蜡粉亮绿结球甘蓝材料LD10；图2为普通有蜡粉结球甘蓝材料21-3；图3为标记BCYM000140在LD10×21-3的F2群体部分单株中的扩增结果。泳道1是MarkerⅠ，泳道2是亲本LD10，泳道3是亲本21-3，泳道4是F1，泳道5-36是F2群体无蜡粉亮绿单株，泳道37-68是F2群体有蜡粉单株；图4为标记BCYM000140在无蜡粉亮绿材料LD10和其余20份有蜡粉材料的扩增结果。泳道1是MarkerⅠ，泳道2是亲本LD10，泳道3是有蜡粉甘蓝材料21-3,泳道4至泳道22是从市场搜集到的19份有蜡粉甘蓝材料，其详细信息见表1。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。生物材料无蜡粉结球甘蓝突变体材料LD10由本所结球甘蓝课题研究组于2010年搜集获得，记载于《结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10遗传规律及分子标记研究》一文中；有蜡粉结球甘蓝野生型材料21-3为本课题组原有自交系材料，记载于《结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10遗传规律及分子标记研究》一文中。试剂与耗材PCR反应所需的试剂，如10×Buffer、dNTP、Taq酶等；以及电泳所用的试剂，如聚丙烯酰胺等均可商购获得；PCR反应所需的试剂还可以是现有市面上常见的PCR试剂盒、PCR反应Mix等等。实施例1、本发明所述分子标记BCYM000140的获得1F2代分离群体的构建利用结球甘蓝无蜡粉突变体材料LD10和有蜡粉野生型材料21-3配制杂交组合，F1群体单株全部表现为有蜡粉性状。F1代自交产生F2代群体，共898株个体，鉴定单株表型，其中有蜡粉单株667株，无蜡粉单株231株，经卡方检验验证其符合3:1的分离比例。2结球甘蓝基因组DNA提取用CTAB法提取亲本及F1、F2代群体叶片的基因组DNA。取大小约为1cm2的真叶至2mL离心管，加入750μLCTAB裂解缓冲液后置于打样器打样5分钟，65℃水浴15分钟，期间每隔5分钟轻微上下颠倒使之充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入750μL氯仿异戊醇24:1，vv，上下颠倒充分混匀，12000rpm4℃离心15分钟。吸取上清液500μL至1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于零下20℃静置120分钟，12000rpm4℃离心15分钟。弃上清，沿离心管壁加入500μL75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁后弃去乙醇。室温干燥沉淀30分钟，加入100μL含RNA酶的TE缓冲液溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ngμL，于零下20℃备用。3分子标记筛选初步筛选：利用双亲LD10和21-3为模板，对本课题组现有的500对EST-SSR引物陈琛等，2010和2780对SSR引物刘东明等，2014进行初步筛选，从中筛选出在双亲间存在多态性、条带清楚、易于识别、并可以稳定扩增的378条引物。二次筛选：根据基于性状表现的分离群体分组分析法BSA原理，在F2群体中随机选取10株无蜡粉亮绿单株和10株有蜡粉单株构建无蜡粉亮绿基因池和有蜡粉基因池，以无蜡粉亮绿基因池、有蜡粉基因池为模板对上述初步筛选出的多态性引物进行再次筛选，获得可能与目标基因连锁的DNA引物1个。对该引物和F2群体单株有无蜡粉性状的连锁关系进行验证，确定该引物与无蜡粉基因cgl-4紧密连锁。开发标记：根据二次筛选获得的标记序列，对结球甘蓝全基因组数据进行比对，发现该引物位于1号染色体。根据结球甘蓝基因组数据，在该引物附件开发了50对引物。验证：用F2群体单株对新开发的引物进行验证，结果表明引物BCYM000140与目的基因连锁最为紧密，为0.28cM,交换率最低，说明与之前获得的标记相比具有较高的选择效率。筛选扩增分子标记时，进行的PCR反应的体系为10μL：模板2.0μL、TaqDNA聚合酶5U·μL-10.2μL、10×PCRbuffer25mmol·L-1MgCl21.0μL、dNTPs2.5mmol·L-10.8μL、ForwardPrimer5pmol·L-10.4μL、ReversePrimer5pmol·L-10.4μL、ddH2O5.2μL。PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸7min，扩增产物4℃保存。采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，设恒定电压160V，银染法染色。经上述步骤，筛选获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记，并命名为BCYM000140。扩增该标记的上下游引物分别为：BCYM000140-FBCYM000140-R:CCCACTTCACTCTGCTTATGGTATGGTCGAAGTGGTATGCSeqIDNo.1SeqIDNo.2；所述引物扩增的结球甘蓝无蜡粉突变体材料LD10基因组DNA的特征条带与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述引物扩增的有蜡粉野生型材料21-3基因组DNA的特征条带与结球甘蓝有蜡粉基因CGl-4紧密连锁为135bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。实施例2、本发明所述试剂盒的组装基于实施例1获得的分子标记BCYM000140，组装本发明所述的试剂盒。所述试剂盒包括扩增所述分子标记BCYM000140的具有SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列的上下游引物。所述试剂盒还包括用于PCR反应和或电泳的常规试剂。具体地，所述用于PCR反应的常规试剂包括：10×Buffer、dNTP、Taq酶等，也可以是常见的可商购获得的PCR试剂盒、PCR反应Mix等。实施例3、采用本发明所述标记或试剂盒进行无蜡粉亮绿结球甘蓝的辅助选择育种以无蜡粉亮绿基因材料LD10与野生型21-3进行杂交。结合分子标记辅助选择，通过多代回交，将LD10的无蜡粉亮绿基因cgl-4导入到21-3中。后代群体中含有LD10带型的单株用于育种改良。实施例4、采用本发明所述标记或试剂盒验证其它遗传背景结球甘蓝材料用实施例1获得的分子标记BCYM000140或实施例2所述的试剂盒在表1所列的19份不同遗传背景的结球甘蓝材料上进行验证，以确定该标记用于其它具有不同遗传背景结球甘蓝材料的分子标记辅助选择的准确性。验证方法采用实施例1描述的PCR反应和电泳检测方法。用现有已知的19份不同遗传背景的结球甘蓝品种材料验证分子标记BCYM000140，如图4所示，条带显示结果与有无蜡粉的表型或后代分离情况的一致性为100％。进一步证实，通过本发明所述分子标记BCYM000140或试剂盒以及本发明所述的方法，可在将无蜡粉亮绿基因cgl-4引入到其他有蜡粉结球甘蓝材料的过程中，在结球甘蓝生长的任意阶段较为准确地进行分子标记辅助选择，从而大大提高育种效率。表1有蜡粉结球甘蓝材料信息

权利要求：1.用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的方法，其特征在于，采用分子标记BCYM000140的引物进行如下步骤：1采用所述分子标记BCYM000140的引物对待选结球甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；2对扩增结果进行凝胶电泳检测；3从电泳检测结果中筛选出与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带一致的材料，所述与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述分子标记BCYM000140的引物具有如下核苷酸序列：BCYM000140-FBCYM000140-R:CCCACTTCACTCTGCTTATGGTATGGTCGAAGTGGTATGC所述引物扩增的与结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述引物扩增的与结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR扩增的反应体系为：15mmolLMgCl2的10×Buffer0.1μLμL，含A、G、C、T各2.5mmolL的dNTP0.08μLμL，上下游引物各0.33μmolμL，Taq酶0.05UμL，模板DNA4ngμL，其余为双蒸水。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s为1个循环，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝胶电泳检测指采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。

百度查询： 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl‑4紧密连锁的分子标记及其应用

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