申请/专利权人：郑州大学第一附属医院

申请日：2016-12-05

公开（公告）日：2018-06-12

公开（公告）号：CN108148805A

主分类号：C12N5/0783(2010.01)I

分类号：C12N5/0783(2010.01)I;A61K35/17(2015.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.07.02#授权;2018.07.06#实质审查的生效;2018.06.12#公开

摘要：本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一种人Tscm细胞及其制备方法和用途，所述制备方法包括以下步骤：1采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；2采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；3将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3CD28 beads、细胞因子IL‑2和二甲双胍metformin的培养基中培养；4每隔2d进行换液并补加细胞因子IL‑2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。本发明的方法可以获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗。

主权项：一种人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；2采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；3将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3CD28beads、细胞因子IL‑2和metformin的培养基中培养；4每隔2d进行换液并补加细胞因子IL‑2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。

全文数据：一种人Tscm细胞及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一种人Tscm细胞及其制备方法和应用。背景技术[0002]随着生物医学领域研究的不断深入，免疫学理论技术的日新月异，免疫治疗成为了人类战胜肿瘤的新希望。免疫活性细胞输注的过继免疫治疗作为免疫治疗的重要组成部分，是指将体外激活的免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。但该疗法在孕育希望的同时也面临着巨大的挑战:过继性细胞免疫治疗输注给患者的免疫细胞处于终末分化状态，在体内存活时间短，抗肿瘤效果受限。如何获得更多年轻化、持久稳定的抗肿瘤细胞，是目前免疫治疗研宄的热点。[0003]CD8+记忆T细胞在抗肿瘤反应中发挥重要作用，分为不同的亚群即干细胞样了细胞Tscm、中心记忆性T细胞Tcm和效应记忆性T细胞Tem。其中Tscm亚群因其具有良好自我更新能力和多能性潜力且具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力而备受关注。[0004]目前，国内外培养扩增Tscm细胞的方法并不能满足临床实际需求，一方面血液来源大多来自于患者或者患者亲属外周血，使得初始细胞的获取大大受限；另一方面，Tscn^ffl胞在体外培养不宜稳定维持，容易进一步分化，使得培养所得^⑽细胞数目较少。因此，如何解决初始细胞的获取以及Tsctn细胞的维持是目前Tscm体外培养的最大瓶颈。[0005]二甲双胍metformin是一种安全高效的双胍类降糖药，作为胰岛素增敏剂，metformin能够通过减少肝糖原异生，增加周围组织对胰岛素的敏感性、抑制肠道细胞吸收葡萄糖发挥降糖作用，有效降低血液胰岛素水平。同时，在细胞能量代谢研宄中发现，二甲双狐疋Hii里调控"[曰号分子腺甘酸活化蛋白激酶AMP-activatedproteinkinase，AMPK的激动剂，激活AMPK负向调控下游哺乳动物雷帕霉素祀点mammaliantargetofrapamycin，mTOR通路D发明内容[0006]本发明主要提供了一种人Tscm细胞及其制备方法和应用，可以获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗。其技术方案如下：[0007]—种人Tscm细胞的制备方法，包括以下步骤：[000S]1采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；[0009]⑵采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；[0010]3将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3CD28beads、细胞因子IL-2和metformin的培养基中培养；[0011]4每隔2d进行换液并补加细胞因子IL-2,扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。[0012]优选的，步骤1中获得人脐带血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人脐带血，先在l5〇Orpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56。：灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25tnin条件下离心，最后吸取白膜层，并用缓冲液清洗，1500rpm，lOmin离心，即获得人脐带血单个核细胞。[0013]优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液，用缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用丨2-14血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的12-14。[0014]优选的，步骤2中用流式细胞分选仪分选初始T细胞亚群具体的方法为，按照每2X106个单个核细胞避光加入1-3uL抗体，所述抗体为CD3-FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞。[0015]优选的，步骤3中刺激剂CD3CD28beads的体积量为初始T细胞体积量的13,细胞因子IL-2的浓度为500-10001111111^，11^;£〇1'111；1_11的浓度为50-150141。[0016]优选的，步骤3中所述培养基为TakaraGT-551培养基，培养条件为37°C、5%⑶2环境。[0017]优选的，步骤3中所述培养基中还包括5%体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为1-3X106mL。[0018]优选的，扩增至14d时CD8+T细胞扩增倍数达180-220倍。[0019]一种人Tscm细胞，其由上述方法获得。[0020]所述的人Tscm细胞可以应用于治疗肿瘤疾病制剂中。[0021]采用上述方法制备人Tscm细胞，其具有以下优点：[0022]与传统的外周血获取初始免疫细胞相比，本发明方法中利用脐带血具有独特的优势:脐带血来源丰富，具有独特的生物、免疫学特性且含有大量的初始T细胞，更易诱导出干细胞样的T细胞，完美的解决了初始细胞获取难题；[0023]在体外实验中，我们首次研宄发现，metformin能够激活T细胞的AMPK信号通路维持Tscm细胞的数目，并且抑制Tscm细胞的进一步分化，大大提高了Tscm细胞体外培养扩增的效率，在维持这群细胞自我更新能力以及多能潜性的同时也保留了Tscm细胞的高效抗肿瘤能力。[0024]从脐带血获得初始T细胞，加入CD3CD28beads和IL-2诱导活化，并采用metfromin维持Tscm细胞的比例，从而获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞，从而获得抗肿瘤活性高、体内存活时间长的T细胞用于临床过继性细胞免疫治疗。[0025]本方法可使Tscm细胞的体外大量培养扩增，可以有效推动细胞免疫治疗的进一步发展，解决目前临床培养技术瓶颈，延长过继免疫细胞在患者体内存活时间，增强其持久高效的抗肿瘤能力，为细胞免疫治疗进一步开展大规模临床治疗打下坚实基础。附图说明[0026]图1为脐带血单个核细胞Tn细胞比例图；[0027]图2为成人外周血单个核细胞Tn细胞比例图；[0028]图3为脐带血单个核细胞和外周血单个核细胞Tn细胞统计图；[0029]图4为对比例1制备的Tscm细胞比例图；[0030]图5为实施例1制备的Tscm细胞比例图；[0031]图6为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞比例的统计图；[0032]图7为流式检测对比例1中的方法杀伤性标记物CD107a的表达图；[0033]图8为流式检测实施例1中的方法杀伤性标记物CD107a的表达图；[0034]图9为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞杀伤比例的统计图。具体实施方式[0035]实施例1[0036]无菌条件下采集脐带血50mL采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞CBMCs，具体步骤如下:先1500rpm，lOmin离心，其升速和减速的加速度均为9ms2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56°C灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9ms2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:3的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的13。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5ms2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，15〇〇rpm，lOmin离心，其升速和减速的加速度均为9ms2，即可获得脐带血单个核细胞。[0037]将上述分离的CBMCs计数，按照每2X106个细胞避光加入2此流式抗体，所述流式抗体为CD3-「11^、€〇84?：-〇7-7、〇〇451^-4?：和〇：1?7-?61^0，进行流式分选〇〇8+〇〇451^+CCR7+T细胞。[0038]将分选的初始T细胞亚群置于含有13T细胞亚群体积量的刺激剂CD3CD28beads和1000IUmLIL-2的GT551培养基中，同时加入5%自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为2X106mL。在37°C，5%C02培养箱中培养，24h后加入100uMmetformin，每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-2。培养至第7d即可获得90%具有Tscm表型的⑶8+T细胞，扩增至14d时其扩增倍数达到220倍。[0039]以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-2为北京双鹫药业股份有限公司生产，metformin购自sigma公司，CD3CD28beads为Lifetechnology公司生产，所述流式抗体购自Biologend公司。[0040]实施例2[0041]无菌条件下采集脐带血50mL采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞CBMCs，具体步骤如下:先1500rpm，lOmin离心，其升速和减速的加速度均为9ms2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56°C灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9ms2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:2的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的14。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5ms2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，lOmin离心，其升速和减速的加速度均为9ms2,即可获得脐带血单个核细胞。[0042]将上述分离的CBMCs计数，按照每2X106个细胞避光加入lyL抗体，所述抗体为CD3-FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选CD8+CD45RA+CCR7+T细胞。[0043]将分选的初始T细胞亚群置于含有12T细胞亚群体积量的刺激剂⑶3CD28beads和900IUmLIL-2的GT551培养基中，同时加入5%自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为3X106mL。在37°C，5%C〇2培养箱中培养，24h后加入50uMmetformin，每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-2。培养至第7d即可获得80%具有Tscm表型的CD8+T细胞，扩增至14d时其扩增倍数达到180倍。[0044]以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-2为北京双鹭药业股份有限公司生产，metformin购自sigma公司，CD3CD28beads为Lifetechnology公司生产，所述流式抗体购自Biologend公司。[0045]实施例3[0046]无菌条件下采集脐带血50mL采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞CBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9ms2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56°C灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9ms2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:4的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的12。最后25〇Orpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5ms2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9ms2,即可获得脐带血单个核细胞。[0047]将上述分离的CBMCs计数，按照每2X106个细胞避光加入3uL抗体，所述抗体为CD3-FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选CD8+CD45RA+CCR7+T细胞。[0048]将分选的初始T细胞亚群置于含有14T细胞亚群体积量的刺激剂CD3CD28beads和5〇OIUmLIL_2的GT551培养基中，同时加入5%自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为1X106mL。在37°C，5%C02培养箱中培养，24h后加入150副metformin，每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-2。培养至第7d即可获得85%具有Tscm表型的CD8+T细胞，扩增至14d时其扩增倍数达到200倍。[0049]以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-2为北京双鹭药业股份有限公司生产，metformin购自sigma公司，CD3CD28beads为Lifetechnology公司生产，所述流式抗体购自Biologend公司。[0050]对比例1[0051]本实施例与实施例1的区别在于，不加metformin，其他培养条件一致。[GG52]检测及结果⑽53]对Tscm细胞的表型、活性以及metformin对Tscm的维持和功能的增强进行检测，以实施例1中的试样为研究对象。具体操作步骤如下：[0054]1•取实施例1中获得的脐带血单个核细胞，并与成人外周血比较Tn细胞比例，结果见图1-3。其中图1为用流式检测脐带血单个核细胞Tn细胞比例，图2为用流式检测成人外周血单个核细胞Tn细胞比例，图3为脐带血单个核细胞和外周血单个核细胞Tn细胞统计图。由图1_3可知，脐带血单个核细胞Tn细胞相较于外周血单个核细胞Tn细胞含量低，所以需对脐带单个核细胞进行诱导活化，从而获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞。[0055]2.Tscm细胞形态和活性检测：显微镜下观察细胞状态，培养至第3d细胞聚团、快速生长，培养至第7d流式细胞术检测细胞的凋亡情况。收集ix1〇6个细胞，重悬于200ULAnnexin-Vbindingbuffer中，避光加入2uLAnnexin-V-APC抗体，4°C避光孵育15min，上机前加入PI。[0056]3.Tscm细胞表型和功能检测：收集培养至第7d和第14d的细胞1X106个，重悬于200此含1%FBS胎牛血清）的PBS中，避光加入流式抗体:CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC、CCR7-Percp和CD95-PE_cy-7,4°C避光孵育15min，流式检测Tscm的表型。采用Diva软件分析培养获得的细胞表型结果显示Tscm比例达到95%，较外周血诱导培养获得的Tscm细胞高30%以上。[0057]4.流式检测检测实施例1制备的Tscm细胞与对比例1制备的Tscm细胞比例，结果如图4-6所示，其中图4为对比例1制备的Tscm细胞比例，图5为实施例1制备的Tscm细胞比例，图6为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞比例的统计图。由结果可知，采用实施例1方法制备Tscm细胞比例高，利于Tscm细胞的诱导及活化。[0058]5.将实施例1制备的Tscm细胞与对比例1制备的Tscm细胞分别与肺癌肿瘤细胞系A549和食管癌肿瘤细胞系TE7共孵育，检测Tscm细胞杀伤性标记物CDl〇7a的表达，结果如图7-9所示，其中图7为流式检测对比例1中的方法杀伤性标记物CD107a的表达，图8为流式检测实施例1中的方法杀伤性标记物⑶的表达，图9为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞杀伤比例的统计图，图7-9表明本发明制备的Tscm细胞杀伤功能较实施例1中方法诱导Tscm细胞杀伤功能高5-10倍，具有较强的抗肿瘤作用。[0059]对于实施例2-3制备的Tscm细胞，在做上述检测后其结果与实施例1的检测结果相似，在此不做赘述。[0060]对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

权利要求：1.一种人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:包括以下步骤：1采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；⑵采用流式细胞分选仪分选⑶8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；⑶将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3CD28beads、细胞因子IL-2和metformin的培养基中培养；⑷每隔2d进行换液并补加细胞因子IL-2,扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。2.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:步骤（1中获得人脐带血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人脐带血，先1500rpm，lOmin离心，将血清转移至无菌的离心管中55-57°C灭活2〇-30min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用缓冲液清洗，1500rpm，lOmin离心，即获得人脐带血单个核细胞。3.根据权利要求2所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:所述缓冲液为PBS缓冲液，用缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用12-14血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的丨〗^^。4.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:步骤2中用流式细胞分选仪分选初始T细胞亚群具体的方法为，按照每2X10s个单个核细胞避光加入l_3yL抗体，所述抗体为CD3_FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选⑶8+CD45RA+CCR7+初始T细胞。5.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：步骤3中刺激剂CD3CD28beads的体积量为初始T细胞体积量的12_14,细胞因子IL-2的浓度为5〇〇-l〇OOIU1111，11»^;^]：111；[11的浓度为5〇-15〇14[。6.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:步骤3中所述培养基为TakaraGT-551培养基，培养条件为37°C、5%C02环境。7.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:步骤3中所述培养基中还包括5%体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为1-3Xl〇6mL。8.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于:扩增至14d时CD8+T细胞扩增倍数达180-220倍。9.一种人Tscm细胞，其特征在于：由权利要求1-8任一项所述的方法获得。10.—种权利要求9所述的人Tscm细胞在治疗肿瘤疾病制剂中的应用。

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