申请/专利权人：中国农业科学院棉花研究所

申请日：2018-06-08

公开（公告）日：2018-11-02

公开（公告）号：CN108728571A

主分类号：C12Q1/6895(2018.01)I

分类号：C12Q1/6895(2018.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.07.16#授权;2018.11.27#实质审查的生效;2018.11.02#公开

摘要：本发明公开了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用。该分子标记为5’‑TAGAAGACTGGA‑3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，其InDel分子标记引物如SEQ ID NO.1‑2所示。采用该InDel分子标记引物即可通过简单的PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳等操作有效鉴定材料中恢复基因的存在与否及是否纯合，从而加快了田间棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育，并保证了棉花恢复系的种子纯度。

主权项：1.一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’‑TAGAAGACTGGA‑3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置。

全文数据：与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDeI分子标记及应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用。背景技术[0002]棉花是我国重要的经济作物，在农业生产中具有重要的地位和意义。杂种优势的研究和利用可以有效地提高棉花产量和抗逆性。杂交制种是当前杂种优势利用的主要体现，棉花杂种一代表现出显著的杂种优势，比常规品种增产15%左右。在实际生产中，棉花可以通过人工去雄授粉法、化学杀雄法和“三系配套”法等方法生产杂交种。人工去雄授粉法费时费力成本较高，所获得的杂交种纯度也普遍偏低;化学杀雄法虽在杂交种制种过程中可免去人工去雄的繁杂，但易造成环境污染，存在稳定性不高等缺陷；“三系配套”法主要是以细胞质雄性不育系为主，在制种过程中可免除人工去雄法以及化学杀雄法费时费力、制种纯度偏低以及易造成环境污染等缺陷，适合大面积制种，可以很好地满足实际生产的需要。[0003]含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质CMS-D2的陆地棉不育系和含有恢复基因的恢复系是棉花杂种优势利用中主要的三系配套系统之一。目前，三系杂交种（以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主）的审定已经取得了一定进展，但棉花中由于恢复基因来源狭窄及恢复能力限制，且恢复基因的克隆和育性恢复的相关机理尚不清楚，使得优良恢复系亲本资源匮乏，造成强优势三系杂交组合的选育过程较为缓慢。因此，在三系杂交棉选育过程中，强恢复力的优良恢复系亲本的选育和改良是育种工作中长期面临的重点和难点。[0004]目前，在对优良恢复系的选育和改良方面，育种家通常可以采用常规的杂交选育技术达到这一目的，但其缺陷是育种周期长，占地面积大，每年都需要大量田间试验来确保含恢复基因材料的存在，费时费力，而且育种效率较低。另一方面，在三系杂交种制种过程中，需要恢复系与不育系杂交来得到杂交种。因此，保证恢复系的纯度至关重要，一旦混杂，将会造成杂交种出现不育的后果，影响棉花产量。因此，急需一种准确高效又快速的分子标记，利用分子标记辅助选择育种技术，能够解决常规育种过程中田间鉴定所需时间长、消耗大、准确性差等缺点，提尚鉴定含恢复基因材料的效率，且保证恢复系种子的纯度，从而加速育种进程，满足实际生产需要。发明内容[0005]为了解决采用常规育种方法，恢复系材料选育和改良过程中田间材料鉴定费时费力、准确性差等缺点，提高鉴定含恢复基因材料的效率，并且在制种过程中保证恢复系种子纯度，本发明提供了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及InDel分子标记引物，从而可以加快棉花恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。[0006]本发明提供的一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’-TAGAAGACTGGA-3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，在恢复系中存在这一插入序列，在不含恢复基因的材料中，不存在这一插入序列。[0007]本发明还提供了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记引物，其特征是，其上游引物为：5’-ATAAATGAATCAGTCAAGACATTTG-3’（SEQIDN0.1;下游引*S:5’-AAAGTGAAGAGGAAAATTTGATGTT-3’（SEQIDN0.2。[0008]本发明还提供了上述的InDel分子标记引物在棉花细胞质雄性不育恢复系选育以及在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。[0009]本发明还提供了一种采用上述的InDel分子标记引物鉴定哈克尼西棉雄性不育恢复系基因的方法，其特征是：[0010]1采用上述的InDel分子标记引物对待测棉花样品的基因组DNA进行PCR扩增；[0011]2对PCR扩增产物进行电泳分析；[0012]如果PCR产物同时扩增出片段长度为206bp和194bp的两条条带，则为恢复基因杂和的材料；[0013]如果PCR产物只扩增出片段长度为206bp的条带，则为恢复基因纯和的恢复系材料；[0014]如果PCR产物只扩增出片段长度为194bp的条带，则为不含恢复基因的材料。[0015]利用该InDel分子标记转化InDel分子标记引物，即可通过简单的PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳等操作，加快田间棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育，保证棉花恢复系种子纯度，成功地将分子标记辅助选择育种技术应用于棉花新恢复系选育和三系杂交种的制种工作中。[0016]通过以上方法，在棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育和改良工作中，可以显著降低田间材料鉴定的工作量，同时更好的保证新恢复系材料和棉花恢复系种子的纯度，加快育种进程，极大地提高育种效率和保证三系杂交种种子纯度，提高棉花产量。[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0018]1准确率高：InDel标记具有简单可靠、可重复、易辨别等优点，只需要经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。本发明利用一对InDel标记引物，能够从分子水平上区分出恢复系材料及三系杂交种，且不受环境因素的影响，提高了鉴别的准确性。[0019]2操作简单，鉴定快速=InDel标记对棉花新恢复系材料的选育和保证三系杂交种种子纯度方面具有重要作用。与常规育种相比，InDel标记省去了大量人力、物力，在新恢复系材料选育和三系杂交种制种过程中，不需要投入大量精力于田间形状调查，省去了大量的测交等田间试验，只需要提取棉花DNA后，用InDel引物扩增后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳即可进行鉴定，整个检测的过程仅需要约2.5小时左右，时间短，效率高。[0020]此外，还可利用该InDel标记通过共显性带型有效鉴定材料中恢复基因的存在与否及是否纯合，从而极大加快新恢复系材料的选育。[0021]3简单实用：与SSR标记和CAPS标记相比，InDel标记具有共显性好、重复性好和多态性丰富等特点之外，以InDel标记进行PCR扩增时，非特异性条带较少。本发明的InDel分子标记在新恢复系材料选育及恢复系种子纯度鉴定过程中，操作简单，共显性好、多态性丰富，具有良好的应用前景。附图说明[0022]图1为:含哈克尼西棉不育胞质的三系材料中Gh_D05G3392基因的启动子序列及参考基因组的序列比对结果，其中白色显示的“TAGAAGACTGGA”为目标序列；其中TM-1为陆地棉参考基因组序列；P92_A、P92_B*P92_R分别为不育系、保持系和恢复系材料中Gh_D05G3392基因的部分启动子序列；[0023]图2为：InDel标记对48份恢复基因近等基因系材料的鉴定结果，其中M:markerTIANGEN公司50bpDNAladder;1-24为不含恢复基因的近等基因系材料A泳道）；25-4833除外为恢复基因位点杂和的近等基因系材料R，33为恢复基因纯和的材料；[0024]图3为=InDel标记对48份恢复基因回交群体材料（BC5F2的鉴定结果，其中M:markerTIANGEN公司50bpDNAladder;其中a泳道为不含恢复基因单株;b泳道为恢复基因位点杂合单株;c泳道为恢复基因位点纯合单株。具体实施方式[0025]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。[0026]实施例1:[0027]我们发现陆地棉基因组Gh_D05号染色体上基因名称为Gh_D05G3392的基因的启动子区域存在InDel序列，该InDel序列位于该基因的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，与恢复哈克尼西棉细胞质雄性不育性状的恢复基因连锁。在含恢复基因的材料中在该位置存在一段12nt的插入序列“TAGAAGACTGGA”，序列编码方向为5’—3’方向；在不含恢复基因的材料中，不存在这一插入序列。[0028]与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，如图1所示，其序列为：5,-TAGAAGACTGGA-3,。[0029]根据该InDel序列和PCR引物设计原则，在其上下游设计引物，成功将其转化为InDe1标记引物，扩增该InDe1分子标记的引物对如表1:[0030]表I:InDel分子标记引物[0031][0032]在恢复基因纯和的恢复系材料中特异扩增出含有该插入序列的206bp的条带，在不含恢复基因的材料中扩增出不含有该插入序列的194bp的条带，在恢复基因杂和的恢复系材料中扩增出含该插入序列的206bp的条带和不含插入序列的194bp的条带。[0033]实施例2[0034]1、棉花细胞质雄性不育恢复基因近等基因系材料和恢复基因回交群体材料BC5F2种子DNA的提取[0035]棉花恢复基因近等基因系材料和恢复基因回交群体材料BC5F2的种子去壳，每粒种子单独粉碎后转入2ml的离心管中；加入800μ1DNA裂解液0.05MTris-Cl，0.OlMEDTA，2%3〇3，1%?¥?，〇.5%山梨醇，〇.7〇51恥：1，调整?!1值为8.〇，高压灭菌；使用前加入1%0-巯基乙醇），混匀后置于65°C水浴30min，每IOmin轻摇一次;水浴后，加入800μ1氯仿:异戊醇24:1，缓慢颠倒混匀至不分层为止，4°C，12000rpm离心IOmin;用无尖的枪头吸取上清液约800μ1转移到另一2ml离心管中，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇24:1，缓慢颠倒混匀至不分层为止，4°C，12000rpm离心IOmin;用无尖的枪头吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.8倍体积冰冷异丙醇，缓慢颠倒至有絮状DNA产生，静置30min;用小枪头挑取DNA转移至1.5ml离心管中，加入70%乙醇洗两次，最后无水乙醇洗一次，每次约五分钟；倒掉无水乙醇，倒置管壁晾干后（约30min，加入ddH20溶解DNA，测定浓度后稀释到50ngAU，4°C保存备用。[0036]2、利用InDel分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系如表2。[0037]表210μ1PCR反应体系[0040]?〇?程序为：94°：预变性3111丨11;94°：变性3〇8,56°：退火158,72°：延伸1〇8,30个循环;然后72°Clmin，4°C保存。[0041]对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶（10%电泳，凝胶成像系统拍照保存，并对电泳结果进行条带统计。[0042]3、检测结果[0043]判断标准：统计中凡是仅出现206bp条带的即为恢复基因纯和的恢复系，仅出现194bp条带的即为不含有恢复基因的材料，若同时出现194bp和206bp条带，则为恢复基因杂和的恢复系材料。[0044]采用InDel标记对48份恢复基因近等基因系材料进行鉴定的结果如图2所示。从图2可以看出：1-24为不含恢复基因的近等基因系材料，在194bp位置出现特异条带;25-4833除外恢复基因位点杂和的近等基因系材料，同时出现194bp和206bp的目标条带，仅33位中只出现了206bp的目标条带，表明33为恢复基因纯和的材料。[0045]采用InDel标记对48份恢复基因回交群体材料BC5F2进行鉴定的结果如图3所示。从图3可以看出：泳道a为不含恢复基因单株，它在以marker为标准的194bp位置出现目标条带，不能在206bp位置处检测到特异条带；泳道b为恢复基因位点杂合单株，它在以marker为标准的194bp和206bp的位置处均能检测到目标条带；泳道c为恢复基因位点纯合单株，仅在以marker为标准的206bp处能检测到目标条带，但在194bp位置处不能检测到目标条带。[0046]通过上述步骤即可简单快速的筛选出含恢复基因的新恢复系材料，并且能够在三系杂交种制种过程中保证恢复系的纯度，可以显著降低田间材料鉴定的工作量，加快常规杂交育种的工作进程，极大地提高育种效率和保证三系杂交种种子纯度，提高棉花产量。[0047]以上所述，仅为本发明最佳的实施方式，任何熟悉本技术领域的科技人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地获得的技术方案的简易变化或等效替换均属于本发明的保护范围。

权利要求：1.一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’-TAGAAGACTGGA-3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置。2.—种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记引物，其特征是，其上游引物为：5'-Ataaatgaatcagtcaagacatttg-S';下游引物为：5'-AAAGTGAAGAGGAAAATTTGATGTT-3,。3.权利要求2所述的InDel分子标记引物在棉花细胞质雄性不育恢复系选育中的应用。4.权利要求2所述的InDel分子标记引物在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。5.—种鉴定哈克尼西棉雄性不育恢复系基因的方法，其特征是，1采用权利要求2所述的InDel分子标记引物对待测棉花样品的基因组DNA进行PCR扩增；2对PCR扩增产物进行电泳分析；如果PCR产物同时扩增出片段长度为206bp和194bp的两条条带，则为恢复基因杂和的材料；如果PCR产物只扩增出片段长度为206bp的条带，则为恢复基因纯和的恢复系材料；如果PCR产物只扩增出片段长度为194bp的条带，则为不含恢复基因的材料。

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