申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2016-07-12

公开（公告）日：2019-08-16

公开（公告）号：CN106075396B

主分类号：A61K38/17(20060101)

分类号：A61K38/17(20060101);A61K48/00(20060101);A61P43/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.08.16#授权;2016.12.07#实质审查的生效;2016.11.09#公开

摘要：本发明提供了Cul4蛋白的应用，属于基因治疗技术领域。本发明通过在酵母中过表达Rtt101蛋白，相当于人类的Cul4蛋白，发现其能够抑制Eco1基因缺失而引起的生长缺陷。因此本发明提供了Cul4蛋白在制备治疗ESCO2Eco1在人细胞中的同源蛋白为ESCO1和ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的遗传疾病药物中的应用，进而治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的相关遗传疾病，例如罗伯茨综合症，具有良好的临床应用前景，且能够取得显著的社会效益。

主权项：1.Cul4蛋白在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或如SEQIDNO.2所示。

全文数据：Cul4蛋白的应用技术领域本发明属于基因治疗技术领域，具体地说，涉及Cul4蛋白包括Cul4A和Cul4B及其在治疗ESCO2基因功能缺失而引起的生长缺陷中的应用。背景技术DNA复制是一切生命活动的基础，约40种疾病的产生和DNA复制相关，目前至少有14种药物靶向作用于DNA复制过程中的蛋白。研究DNA复制与人类疾病的关系能从深层次挖掘疾病发生的机制，为新药研发和疾病治疗提供理论基础。遗传物质的正确传递对基因组的稳定性至关重要，姐妹染色单体粘连在其中发挥不可或缺的作用。姐妹染色单体粘连sisterchromatidcohesion，SCC是两条姐妹染色单体结合在一起建立粘连并解离的过程，其过程受到严格调控，SCC的建立对于姐妹染色单体的分离和遗传物质的正确传递具有重要的意义。SCC功能的发挥主要依靠粘连蛋白及其调节蛋白共同完成，其中粘连蛋白是由Smc1，Smc3，Scc1和Scc3构成的四元环状复合物。在细胞周期的G1期，粘连蛋白结合到染色体上，此时在负调控因子的作用下，结合是不稳定的，环形的粘连蛋白会在染色体上进行滑动；随着细胞周期的行进，细胞进入S期，乙酰转移酶Eco1将粘连蛋白的Smc3亚基进行乙酰化，乙酰化后的粘连蛋白稳定结合在染色体上；在G2期，姐妹染色单体粘连稳定建立，并能拮抗负调控因子的作用；细胞进入有丝分裂期的后期以后，分离酶将粘连蛋白的Scc1亚基进行切割，粘连蛋白从染色体上脱离，去乙酰化酶Hos1对Smc3进行去乙酰化，两条姐妹染色单体被分向两个子细胞的两极，确保遗传物质的稳定性。SCC不仅参与DNA复制，DNA损伤修复等多种生物学过程也需要SCC的参与。已有文献报道，当SCC的建立发生问题后，将会造成包括黑色素瘤，结肠癌，胚胎癌，乳腺癌，前列腺癌等在内的多种严重疾病的发生。研究SCC的建立和疾病的关系，将会给治疗多种遗传疾病带来新的希望。姐妹染色单体粘连的建立需要乙酰转移酶Eco1参与其中。Eco1首次发现是在酵母突变体中，此突变体表现出染色体丢失率提高，且在异染色质重组过程中也有缺陷。随后，Eco1相继在其它生物中被发现，并且都是必需基因。通过对不同物种中Eco1的序列进行比对发现不同物种的N端长度有所不同，但是其C端序列非常保守，为乙酰转移酶活性中心。缺失乙酰转移酶活性的细胞会产生大量的姐妹染色单体粘连缺陷，继而导致死亡，表明Eco1的主要功能是其乙酰转移酶的作用。在人细胞中，存在两种Eco1的同源蛋白ESCO1和ESCO2，此两种蛋白都可以对Smc3进行乙酰化，但它们的功能也有所不同，并非完全冗余。不管缺失哪个ESCO蛋白，另一个蛋白均无法完全回补其所引起的缺陷。ESCO2突变后会导致一种发育失常疾病，称为罗伯茨综合症Robertssyndrome，RBS。罗伯茨综合症RobertsSyndrome是由并且仅仅由ESCO2基因的突变导致的疾病，症状包括患者生长迟缓、肢体发生畸形、手畸形、颅面骨畸形等，还会引起心脏、肾、生殖器及头发的异常。ESCO2基因的转录产物有3376个核苷酸，成熟的mRNA由1806个核苷酸组成，编码601个氨基酸。ESCO2蛋白N端含有与染色质结合的结构域，C端具有乙酰转移酶活性。ESCO2突变会导致罗伯茨综合症。除两例外，大部分突变都是移码突变或者无义突变，造成蛋白质截短或者无功能的蛋白质。另外两例属于错义突变，由于乙酰转移酶结构域高度保守的氨基酸残基被替代，造成乙酰转移酶活性丧失。在人细胞中，ESCO2是建立染色单体粘连所必需的。DNA的复制和修复过程受到泛素化修饰的调节，尤其是受到Cullin4Cul4-RINGE3泛素连接酶的调控。所有的Cullin通过C-端区域与RINGfingerproteinRbx1Hrt1相互作用，然后招募E2泛素结合酶。Cullin的N-端结构域分别与不同种类的底物特异的接头蛋白adaptor相互作用。人基因组表达两种Cul4的同源蛋白：Cul4A蛋白和Cul4B蛋白，它们通过N-端区域与Ddb1蛋白相互作用，然后Ddb1蛋白与各种底物特异的接头蛋白相互作用。这些接头蛋白adaptor叫做DCAFsDdb1-Cul4associatedfactors。但是，对于DNA复制和修复中泛素化底物以及DCAFs参与的调节机制尚不清楚。目前常用的基因治疗方法有两种：一种方法是“体外法”，即将外源基因导入体外培养的受体细胞，经过适当的筛选方法，把重组的受体细胞回输患者体内，让外源基因表达发挥作用，以缓解患者症状。另一种称为“体内法”，指直接将外源DNA注射至机体内，DNA可以单纯注射，也可以与辅助物如脂质体一起注射，使外源基因在体内转录、翻译而发挥治疗作用。体内法的基因治疗方式比体外法简单、直接、经济，疗效也比较确切。常用的方式有病毒介导、寡核苷酸直接注射、脂质体介导和体内基因直接注射等。现有技术中，涉及Cul4蛋白的研究主要体现在通过降低Cul4B的活性，从而抑制肿瘤细胞的生长专利号CN201210313850.8，CN201380055020.2。没有涉及Cul4蛋白在ESCO2基因缺陷引起的遗传疾病方面的研究报道。发明内容本发明的目的是针对目前的基因疗法存在靶向性不够精确、需要开发更多的治疗基因以获得更好的疗效的现状，提供与ESCO2突变引起的遗传疾病相关的基因及其应用。为实现本发明的目的，本发明通过在酵母中过表达Rtt101相当于人类的Cul4蛋白，发现过表达Cul4蛋白能够抑制Eco1基因缺失而引起的生长缺陷。进而，本发明提供了Cul4蛋白在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列或含有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。本发明提供了编码Cul4蛋白的基因在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述编码Cul4蛋白的基因含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或含有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。本发明提供了一种蛋白过表达促进剂在制备ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病治疗药物中的应用，所述蛋白含有Cul4A蛋白或Cul4B蛋白；所述Cul4A蛋白含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述Cul4B蛋白含有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。本发明提供了含有Cul4蛋白编码基因的生物材料在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白编码基因含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或含有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。上述应用中，所述的生物材料为表达载体或宿主细胞。所述的疾病为罗伯茨综合症。本发明还提供了含有Cul4蛋白或其编码基因的药物，所述Cul4蛋白含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列或含有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；Cul4蛋白编码基因含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或含有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。本发明能够解决目前的基因疗法存在的不足：靶向性不够精确；需要开发更多的治疗基因以获得更好的疗效。本发明中发现Cul4基因可作为新的治疗基因，具有广阔的前景。本发明发现在酵母中过表达Rtt101能够抑制Eco1基因缺失而引起的生长缺陷图1,同时也可以回补由于Eco1基因缺失而引起的Smc3乙酰化水平的下降图2。这一机制在真核生物中是保守的。因此，对于ESCO2基因功能缺陷引起恶性罗伯茨综合症的患者，本领域技术人员可以通过以下技术方案实现该疾病的治疗：1在体细胞内导入Cul4基因包含Cul4A和或Cul4B基因，利用病毒方法或非病毒方法两种方式之一。病毒方法可以采用将Cul4构建至腺病毒载体中，非病毒方法可以将外源DNA片段直接导入至细胞中。使Cul4蛋白在患者体内过表达，以抑制ESCO2基因功能缺陷，达到治疗的目的。2直接注射Cul4重组蛋白，弥补ESCO2基因功能缺陷。构建表达Cul4重组蛋白质粒，令Cul4重组蛋白大量表达，对表达的Cul4重组蛋白进行纯化，将纯化后的Cul4蛋白直接注射至罗伯茨综合症患者体内。附图说明图1为过量表达泛素连接酶复合物Rtt101Mms1的Rtt101亚基能抑制eco1-1突变体的高温生长缺陷示意图。用梯度稀释实验观察各突变菌株在25℃，30℃，34℃，37℃的生长情况。实验结果显示，过量表达Rtt101使在30℃，34℃，37℃致死的突变体得以正常生长。AD-Eco1为正对照。图2为过量表达泛素连接酶复合物Rtt101Mms1的Rtt101亚基能修复eco1-1突变体中Smc3的乙酰化缺陷示意图，野生型和各突变体菌株中通过TCA提取的全细胞蛋白分别用图中所示抗体进行免疫印迹WesternBlot检测。结果显示在eco1-1突变体中过量表达Rtt101时，可将突变体中较低量的Smc3乙酰化回补至与野生型同一水平。其中WesternBlot结果以微管蛋白Tubulin作为上样量对照。AD为载体pGADT7的简称，指在酵母细胞中表达了pGADT7的空载体作为对照。AD-Rtt101为载体pGADT7-Rtt101的简称,在酵母细胞中表达了pGADT7-Rtt101作为实验组。α-ac-Smc3指识别Smc3乙酰化的抗体，α-Smc3指识别Smc3的抗体，α-Tubulin指识别Tubulin的抗体。图3为人细胞ESCO2与酵母Eco1蛋白序列比对结果图，ESCO2和Eco1在NCBI中gi号分别为gi62899035和gi14318550，从图中可以看出此两种蛋白N端变化较大，但是C端乙酰转移酶结构域非常保守ESCO2534-601位氨基酸,Eco1211-281位氨基酸。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。下列实施例中，Phusion高保真聚合酶购自Thermofisher，Pfu购自全式金生物公司，Tag聚合酶购自Takara公司，限制性内切酶购买自NEB公司，T4连接酶购买自NEB公司，pRS313,pRS316,pGADT7,pAG25购自Addgene，引物由生工生物公司合成。实施例1eco1-1突变体菌株的构建1、构建酿酒酵母中乙酰转移酶Eco1的表达载体：pRS316-Eco1,pRS313-Eco1pRS316是以URA为营养筛选标记的酵母表达载体,pRS313是以HIS为营养筛选标记的酵母表达载体1以酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741的基因组DNA为模板，用Pfu聚合酶PCR扩增Eco1目的片段：Eco1-F：5’-CGCGGATCCCAATTTGATCTTTTTATAAA-3’；Eco1-R：5’-CCGGAATTCTCATATGTATACCGGCAATA-3’然后用多功能DNA纯化试剂盒回收PCR产物。2用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切Eco1目的片段和载体pRS316。反应体系：反应缓冲液5μL，分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小时。3电泳，用胶回收试剂盒回收酶切产物。4取3μL回收产物进行电泳，估测DNA浓度。设置连接反应体系：载体100ng，目的片段目的片段与载体摩尔比为3:1-10:1，T4DNA连接酶1μL，加水至10μL，16℃过夜连接。5取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于LB固体培养基含氨苄霉素，37℃倒置培养16小时。6挑取菌落至5mLLB液体培养基含氨苄霉素中，37℃、220rpm培养12小时。7用碱裂解法提取质粒。8将质粒进行酶切鉴定，反应体系为：反应缓冲液1μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5μL，质粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小时，电泳检测大小。9将酶切正确的质粒送测序,得到正确的pRS316-Eco1载体，pRS313-Eco1载体的构建与pRS316-Eco1载体的构建方法相同。2、构建酿酒酵母中乙酰转移酶Eco1突变体eco1-1的表达载体pRS313-eco1-11设计突变位点引物。点突变引物为：eco1-1G211D-F：5-CCCGATTTTAAGATTGACATATCGAGAATTTGGGTGTG-3’；eco1-1G211D-R：5-CCAAATTCTCGATATGTCAATCTTAAAATCGGGGTAC-3’。2以pRS316-Eco1，pRS313-Eco1为模板，进行PCR。设置PCR反应体系：5×HFBuffer10μL；dNTPs10mM1μL；Template5-50ng1μL；上述上下游引物各0.5μL；Phusion高保真聚合酶0.5μL；DMSO1.5μL加H2O至50μL。注意Phusion聚合酶需要热启动，应最后加入，加入后立即反应。反应程序：98℃5分钟；98℃10秒，58℃30秒，72℃4分钟延伸时间＝模板长度2kb分钟，17个循环；72℃20分钟；采用如上PCR体系和程序进行PCR扩增。3取10μLPCR产物加入1μLDpnⅠ，37℃消化模板因为质粒DNA存在甲基化修饰，而PCR产物没有甲基化修饰，而DpnⅠ只作用于存在甲基化修饰的DNA。4将消化后的体系取5μL转化DH5α，将转化子提取质粒并测序。得到正确的pRS313-eco1-1载体。3、运用PlasmidShuffling实验获得eco1-1突变菌株因乙酰转移酶对于酿酒酵母的生长是必需的，因此对基因组上的ECO1基因进行改造时，需提前转入一个能够表达Eco1蛋白的质粒。1pRS316-Eco1和pRS313-eco1-1质粒的酵母转化1以酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741作为背景菌株接入液体培养基中，30℃培养至2×107个细胞mLOD600＝1.0。25mL的培养菌液以2500g，30s的离心条件将细胞收集至无菌1.5mL离心管中，去掉上层液体培养基。3将细胞悬浮于1mL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。4将细胞悬浮于1mL0.1molL乙酸锂溶液中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。5将1mL单链载体DNA样品煮沸5min，快速在冰水中冷却。6在离心后的细胞上层添加转化混合液，转化混合液组成如下，按下列顺序添加：PEG335050％WV240μL，1molLLiOAc乙酸锂36μL，单链载体DNA2mgmL50μL，需转化的pRS316-Eco1和pRS313-eco1-1各1μL,无菌超纯水32μL，总体积360μL。添7以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。8将细胞悬浮于1mL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。9将细胞悬浮于100μL无菌超纯水中，均匀涂抹于SC-URA-HIS固体培养基上，30℃倒置培养24-72h，即可得到带有pRS316-Eco1和pRS313-eco1-1质粒的菌株：BY4741pRS316-ECO1pRS313-eco1-1。2利用同源重组对基因组上的ECO1进行敲除1以pAG25质粒为模板，设计5’末端含有目标序列位置上下游各39nt同源臂的一对引物，PCR扩增该置换片段。所用引物如下：eco1-del-F:5’-ACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAAACATGGAGGCCCAGAATACCCT–3’；eco1-del-R:5’-ATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC–3’。2以pAG25质粒为模板，用Tag聚合酶PCR扩增能同源替换基因组上ECO1的带有表达NAT抗性的目的片段。PCR反应体系：2×Tag聚合酶25μL；Template5-50ng1μL；PrimerF2μL；PrimerR2μL；；加H2O至50μL。反应程序：95℃5分钟；95℃1分钟，58℃30秒，72℃2分钟延伸时间＝模板长度1kb分钟，30个循环；72℃20分钟；采用如上PCR体系和程序进行PCR扩增。3利用上述酵母转化的方法将PCR得到的目标片段转入BY4741pRS316-Eco1pRS313-eco1-1菌株中。均匀涂抹于SC-URA-HIS+NAT的固体培养基，倒置培养。挑取转化子单菌落，划线于新固体平板上。挑取菌体，快速提取酵母基因组，PCR鉴定DNA片段是否发生置换。最后得到基因组上ECO1敲除的菌株：BY4741eco1Δ::NATpRS316-Eco1pRS313-eco1-1。4运用PlasmidShuffling实验获得eco1-1突变菌株。5-氟乳清酸5-FOA是作为一种负筛选药物，在酵母细胞能表达URA3时，URA3基因编码的酶可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长。而上述实验提到的pRS316-Eco1质粒可表达URA3，因此通过加入5-FOA可筛选到pRS316-Eco1丢失的菌株。将上述步骤得到的菌株：BY4741eco1Δ::NATpRS316-Eco1pRS313-eco1-1划在SC-HIS+5-FOA的平板上进行筛选，得到的菌株即为乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1：BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1。实施例2泛素连接酶Rtt101-Mms1的亚基Rtt101回补乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1的鉴定1、泛素连接酶Rtt101-Mms1回补乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1的相关载体pGADT7-Eco1、pGADT7-Rtt101的构建pGADT7是以LEU为营养筛选标记的酵母表达载体1以酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741的基因组DNA为模板，用Pfu聚合酶PCR扩增Eco1、Rtt101的目的片段。所用引物序列如下：Eco1-2-F：5’-CCGGAATTCATGAAAGCTAGGAAATCGCA-3’Eco1-2-R：5’-CGCGGATCCTCATATGTATACCGGCAATA-3’Rtt101-F：5’-TCCCCCCGGGACAGGAACAATGATAAATGAGAG-3’Rtt101-R：5’-ACGCGTCGACTCGAGAGATGGCACCAGTCTTAGTAC-3’然后用多功能DNA纯化试剂盒回收PCR产物。2用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切目的片段ECO1和载体pGADT7。反应体系：反应缓冲液5μL，分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小时。3用XmaⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段Rtt101和载体pGADT7。反应体系：反应缓冲液5μL，分别加入XmaⅠ和XhoⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小时。4电泳，用胶回收试剂盒回收酶切产物。5取3μL回收产物进行电泳，估测DNA浓度。设置连接反应体系：载体100ng，目的片段目的片段与载体摩尔比为3:1-10:1，T4DNA连接酶1μL，加水至10μL，16℃过夜连接。6取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于LB固体培养基含氨苄霉素，37℃倒置培养16小时。7挑取菌落至5mLLB液体培养基含氨苄霉素中，37℃、220rpm培养12小时。8用碱裂解法提取质粒。9将质粒进行酶切鉴定，1pGADT7-Eco1反应体系为：反应缓冲液1μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5μL，质粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小时，电泳检测大小。2pGADT7-Mms1反应体系为：反应缓冲液1μL，XmaⅠ和XhoⅠ各0.5μL，质粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小时，电泳检测大小。10将酶切正确的质粒送测序，得到正确的pGADT7-Eco1、pGADT7-Rtt101载体。构建得到泛素连接酶Rtt101-Mms1回补乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1的相关载体pGADT7-Eco1、pGADT7-Rtt101。2、泛素连接酶复合物Rtt101-Mms1回补乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1的菌株构建利用酵母转化的方法将步骤1中得到的表达载体转入实施例1制得的乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1中即：BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1中，最后得到泛素连接酶复合物亚基的过量表达回补菌株。1以实施例1制得的乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1中即：BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1作为背景菌株接入液体培养基中，30℃培养至2×107个细胞mLOD600＝1.0。25mL的培养菌液以2500g，30s的离心条件将细胞收集至无菌1.5mL离心管中，去掉上层液体培养基。3将细胞悬浮于1mL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。4将细胞悬浮于1mL0.1molL乙酸锂溶液中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。5将1mL单链载体DNA样品煮沸5min，快速在冰水中冷却。6在离心后的细胞上层添加转化混合液，转化混合液由组成如下，按下列顺序添加：PEG335050％WV240μL，1molLLiOAc乙酸锂36μL，单链载体DNA2mgmL50μL，需转化的pGADT7，pGADT7-Eco1,或pGADT7-Rtt1011μL,无菌超纯水32μL，总体积360μL。添加完成后剧烈震荡至整个体系完全混匀，置于冰上3min。742℃热激40min。8以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。9将细胞悬浮于1mL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。10将细胞悬浮于100μL无菌超纯水中，均匀涂抹于SC-HIS-LEU固体培养基上，30℃倒置培养24-72h。11挑取转化子单菌落，划线于新固体平板上。12同时在乙酰转移酶Eco1功能正常的细胞中即背景菌株13最后得到泛素连接酶复合物亚基的过量表达回补菌株。即BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7；BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7-ECO1；BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7-RTT101；3、通过免疫印迹实验检测泛素连接酶Rtt101对乙酰转移酶缺陷突变体eco1-1的回补。1TCA-丙酮法提取酵母细胞总蛋白收集5OD的酵母细胞，用1mL0.25molLNaOH，1％β-巯基乙醇重悬菌体，用移液器吹打均匀，冰上放置10min。加入160μL50％TCA溶液，振荡混匀后置冰上10min。以15000g转速、4℃离心10min，除尽上清。用1mL预冷丙酮重悬沉淀，使用微量移液器吹打至沉淀至其充分分散，以15000g转速、4℃离心10min，除尽上清。将沉淀在60℃烘箱中烘干，用1×SDS蛋白加样缓冲液悬浮沉淀，沸水浴5min。其中1×SDS蛋白加样缓冲液组分：Tris-ClpH6.850mmolL,SDS2％，溴酚0.1％,甘油10％,β-巯基乙醇100mM。2免疫印迹将上述样品进行8％的SDS-PAGE凝胶分离。将完成电泳的SDS-PAGE凝胶放置于转膜缓冲液中平衡。裁取与凝胶等大的PVDF膜，甲醇中浸泡1min激活后，置于转膜缓冲液中平衡。打开夹板，将黑色夹板一侧浸泡于转膜缓冲液中，从下到上分别放置已浸泡过的海绵垫和两张合适大小的滤纸。整个部分浸没于转膜缓冲液中，防止气泡产生。在滤纸上以从下到上的顺序放置，凝胶、PVDF膜和两张浸泡过的滤纸。整个动作浸没于转膜缓冲液中以防止气泡产生。最后放置浸泡过的海绵垫于最上层，收紧闭合转膜夹板，对准电极，插入转膜槽中。250mA，1h，4℃转膜电泳。转膜完成后，取出PVDF膜，置于用PBST配制的5％脱脂牛奶中，室温封闭1h。去掉封闭液，将抗体用PBST配制的2％脱脂牛奶稀释至合适浓度，室温孵育1h。anti-ac-Smc3，anti-Smc3，anti-Tubulin去掉一抗液，室温下用PBST洗PVDF膜3次，每次10min。将相应二抗用PBST配制的2％脱脂牛奶稀释至合适浓度，室温孵育1h。去掉二抗孵育液，室温下用PBST洗PVDF膜3次，每次10min。将ECL显色液A、B等量混合后，与PVDF膜室温反应3min，去掉膜上多余显色液，将PVDF膜封好后固定在暗匣中，暗室曝光显影。结果见图2。实施例3酵母中过表达Rtt101相当于人类的Cul4蛋白能够抑制Eco1基因缺失而引起的生长缺陷用实施例2中得到菌株进行梯度敏感实验。即：BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7；BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7-ECO1；BY4741eco1Δ::NATpRS313-eco1-1pGADT7-RTT101；具体操作如下：1将上述菌株过夜培养，实验当天对细胞进行计数，并将所有实验菌株的细胞浓度用水调至2×106个细胞mL。2吸取250微升各实验菌株细胞，滴加到96孔板第一列，用多通道微量移液器在96孔板第二列至第五列滴加200微升灭菌超纯水。3从96孔板第一列至第六列共设五个稀释度，使用多通道微量移液器从第一列吸取50微升的细胞至第二列充分混匀，再从第二列吸取50微升细胞至第三列，以此步骤进行5倍的梯度稀释。4使用多通道微量移液器吸取从各稀释度吸取5微升细胞滴加至-HIS-LEU平板上，每个稀释度滴加的酵母斑点之间的距离为1.5cm。温度梯度平板分别在25℃，30℃，34℃和37℃进行培养。5在培养48小时后进行拍照记录实验结果，结果见图1。图1为过量表达泛素连接酶复合物Rtt101Mms1的Rtt101亚基能抑制eco1-1突变体的高温生长缺陷示意图。用梯度稀释实验观察各突变菌株因为染色单体粘连SCC的机制从酵母到人都是保守的，人乙酰化Smc3的乙酰化酶ESCO2和酵母中的Eco1也是高度保守的图3，所以该结果可以运用到由人类ESCO2引起的疾病治疗。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.Cul4蛋白在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。3.编码Cul4蛋白的基因在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述编码Cul4蛋白的基因为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。5.含有Cul4蛋白编码基因的生物材料在制备治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白编码基因为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或为如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。6.如权利要求5所述的应用，所述的生物材料为表达载体或宿主细胞。7.如权利要求5所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。8.含有Cul4蛋白或其编码基因的用于治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病的药物，所述Cul4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或如SEQIDNO.2所示；Cul4蛋白编码基因为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

百度查询： 中国农业大学 Cul4蛋白的应用

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