申请/专利权人：河南工业大学;河南水利与环境职业学院

申请日：2019-06-12

公开（公告）日：2019-09-06

公开（公告）号：CN110204654A

主分类号：C08F222/14(20060101)

分类号：C08F222/14(20060101);C08F220/06(20060101);C08G83/00(20060101);B01J20/281(20060101);G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/14(20060101);G01N30/08(20060101);G01N30/74(20060101);G01N30/86(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.12.28#发明专利申请公布后的视为撤回;2020.02.04#实质审查的生效;2019.09.06#公开

摘要：本发明属于分子印迹聚合物领域，公开了一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。选用金属有机骨架材料HKUST‑1为载体，7‑乙酰氧基‑4‑甲基香豆素为黄曲霉毒素的替代模板，合成表面印迹聚合物HKUST‑1@MIPs。将合成的聚合物用作吸附剂制备表面印迹固相萃取柱，对食品中黄曲霉毒素进行萃取和分离，得到了一种快速、高效、廉价的黄曲霉毒素样品前处理方法，与高效液相色谱结合，研发了一种价格低廉、操作简单、检出限低的食品中黄曲霉毒素的检测方法。有利于开发农作物毒素检测样品前处理，解决当前前处理方法成本高，耗时长的问题。

主权项：1.一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成：将HKUST-1超声分散于无水乙醇中，称取7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入单体α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入偶氮二异丁腈，超声后移至反应瓶中，加入乙醇，加热磁力搅拌，将得到的产物置于烘箱中干燥得目标物。

全文数据：基于HKUST-1的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用技术领域本发明属于分子印迹聚合物领域，涉及一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其农作物检测方面应用。背景技术农作物在生长、收获、储存和加工的过程中容易受到真菌的感染从而产生黄曲霉毒素Aflatoxins，AFs，AFs属于真菌毒素的一种，是黄曲霉菌感染农作物后产生的有毒代谢产物，对人体中的一些生物系统和器官具有严重的的毒害和致癌作用作用。黄曲霉菌代谢产生的AFs会被留在农产品当中，若农产品被加工成食品，人类食用后会对人体造成损害；若农产品被加工成饲料喂养牲畜，AFs会在牲畜体内聚集，当人们使用肉类产品仍会受到AFs的危害。AFs种类较多，不同种类AFs的结构有一些差别，其中黄曲霉毒素G2，G1，B2和B1AFG2，AFG1，AFB2和AFB1结构类似，是AFs中对人体的毒害最大的四种。AFs具有很好的稳定性，通过普通的光照等方法不能将农作物中的AFs分解。由于AFs对农作物的污染范围大、种类多，分布广阔，各个国家的地区的农作物都会受到AFs的污染，如花生、玉米、大豆、小麦、木耳、各种水果等。因此，世界各国和地区制定了食品中AFs的限量标准。AFs对食品的污染问题日益受到人们的关注。如何从复杂的食品样品中快速、准确、有效的萃取分离AFs成为研究热点。针对AFs的检测有许多中方法，使用色谱法、光谱法、免疫法、生物传感器等都可以对AFs进行检测。但是实际样品的前处理过程是制约检测的灵敏度的重要因素。前处理过程既要富集目标物质，也要排除杂质的干扰，防止杂质的存在对检测的灵敏度造成影响。因此，如何建立一种快速、高效的AFs样品的前处理方法成为研究热点之一。在检测四种AFs时，使用了多种样品前处理方法。第一种，样品前处理使用免疫亲和柱；第二种，样品前处理使用固相萃取法；第三种，样品前处理使用免疫亲和柱；第四种为酶联免疫吸附筛查法；第五种为薄层色谱法。而这五种前处理技术也是技术较为成熟的处理AFs的方法。液液萃取法是利用有机试剂对AFs不同的溶解能力萃取AFs。因此，液液萃取法需要用到大量的有机试剂，如甲醇、乙腈等，导致前处理的成本较高，并会对环境造成危害。而且液液萃取法使用有机试剂将AFs从样品中萃取出来需耗费大量的时间。同时，由于实际样品中基质比较复杂，能够溶于有机试剂中的杂质较多，在使用液液萃取法萃取AFs的同时，有可能将其他杂质同AFs一起萃取到有机试剂中，从而影响检测结果的准确性。固相萃取法通过吸附剂对样品中目标物和杂质的保留能力的不同，可以分离目标物和杂质。通常是将硅胶、C18等固定相装入固相萃取小柱中，制成固相萃取柱，利用柱填料对AFs的吸附能力将AFs富集到柱填料上，选取AFs的不良溶剂洗去杂质，最后用AFs的良溶剂洗脱AFs。使用固相萃取柱对AFs进行前处理可以一步完成样品的富集与净化。使用固相萃取柱对实际样品进行前处理具有以下优点：操作简便，节省试剂，重现性好，价格较低。但固定相对AFs没有特异性吸附能力，容易将其他杂质吸附到固定相上，会影响含有AFs样品的检测结果。免疫亲和萃取法是利用生物学中抗原与抗体能够特异性识别的原理，以抗原抗体中的一方作为配基亲和吸附AFs。但是，免疫亲和柱的存放条件较为严格，需要低温进行保存，而在使用免疫亲和柱是需要在常温下使用，这就限制了免疫亲和柱的使用。而且使用免疫亲和柱检测实际样品花费较大。酶联免疫吸附筛查法是利用酶的颜色反应对AFs进行筛查。但是酶联免疫吸附筛查法检测AFs无法做到准确定量，若检测出样品中含有AFs，还需使用其他方法进行准确定量。现行的AFs样品前处理方法都有各自的缺点，因此，需要研发一种价格低廉、适用范围广、灵敏度高的AFs的前处理方法。目前，使用分子印迹聚合物MolecularlyImprintedPolymers，MIPsMIPs作为吸附剂，制备分子印迹固相萃取MolecularlyImprintedSolidPhaseExtraction，MIPSE柱用于样品前处理的技术受到人们的关注。使用MIPSE柱不仅操作简单，且萃取和分离能够一步完成，还具有对目标物质进行特异性吸附的能力。因此分子印迹与固相萃取相结合能够一步完成对目标分子的萃取、富集，操作简便且可以自动化处理批量样品，节省前处理时间，减少操作产生的误差，节省大量有机试剂，对环境保护有益，而且经济适用，节约检测成本，可大规模应用于食品安全、环境保护、农药残留和爆炸物检测等多个方面。虽然分子印迹与固相萃取相结合的方法能够有效的萃取目标分子，但传统的分子印迹聚合物也存在一些缺点：不易将模板分子完全洗脱；传质速率较低；聚合物形状不规则；吸附量较低等WangY,YangY,LanX,etal.BisphenolAsensingbasedonsurfacemolecularlyimprinted,orderedmesoporoussilica[J],ElectrochimicaActa,2011,565:2105-2109.；HongliangH,XiaoliG,LiyingS,etal.MolecularlyimprintedpolymersbasedonSBA-15forselectivesolid-phaseextractionofbaicaleinfromplasmasamples[J],AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2015,4072:509-519.，而表面印迹技术能够很好地弥补以上缺点。表面分子印迹技术常用的方法是将具有作用位点的印记聚合物接枝或包覆在载体材料表面，这样使得作用位点暴露在表面分子印迹聚合物的近表面、表面，增加传质速率和效率。相比于传统印迹技术，表面印迹聚合反应发生在载体表面，使能够对目标分子特异性识别的结合位点更多的暴露在吸附材料的表面，具有更大的比表面积，传质速率更高，有利于模板的洗脱和再次结合。表面印迹聚合物需要合适的载体，载体的选择影响着表面印迹聚合物的吸附性能HuX,XieL,GuoJ,etal.Hydrophilicgallicacid–imprintedpolymersovermagneticmesoporoussilicamicrosphereswithexcellentmolecularrecognitionabilityinaqueousfruitjuices[J],FoodChemistry,2015,179:206-212.。为了达到所需的形态结构，合适的粒径和孔径，载体材料的选择显得尤为重要。因此选择新型的、比表面积大、吸附能力强的载体材料，并将其应用于毒素的分析变得更有意义。常用的载体材料具备多孔性、表面可修饰等特点，目前研究较多的有氧化石墨烯、磁性四氧化三铁、碳纳米管和金属有机骨架等。其中金属有机骨架材料作为一种新型纳米材料，因其具有高稳定性、结构易于调控、易功能化、合成条件温和，引起了广泛的关注和研究。目前未见利用金属有机骨架材料做为载体制备表面分子印迹聚合物用于小麦毒素等农作物的检测。发明内容针对小麦等农作物中真菌毒素的样品前处理，本发明目的在于研发出一种快速、灵敏且价格低廉的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，替代免疫亲和柱，实现小麦等农作物黄曲霉毒素的检测。为实现本发明目的，技术方案如下：本发明以与AFs有着类似结构的化合物7-乙酰氧基-4-甲基香豆素为模板，选择金属有机骨架Metal-OrganicFrameworks，MOFsHKUST-1为表面印迹聚合物的载体。金属有机骨架材料HKUST-1具有多孔，比表面积大、结构稳定、易合成等特点。通过HKUST-1表面裸露的不饱和作用位点Cu2+与单体和交联剂的羰基和羧基的配位作用，可在HKUST-1的表面合成一层分子印迹聚合物，从而制备成AFs表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs。具体通过如下方法制备而成：将HKUST-1超声分散于无水乙醇中，称取7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入单体α-甲基丙烯酸α-MAA、乙二醇二甲基丙烯酸酯Ethyleneglycoldimethacrylate，EGDMA，再加入偶氮二异丁腈AIBN，超声后移至反应瓶中，加入乙醇，加热磁力搅拌，将得到的产物置于烘箱中干燥得目标物。优选条件：模板分子7-乙酰氧基-4-甲基香豆素与α-MAA和EGDMA用量的比例摩尔比为：1:6:40，反应温度80℃。通过优化α-MAA和EGDMA用量的比例，反应温度，模板用量等，确定HKUST-1@MIPs表面的聚合物对AFs具有最大吸附量。再通过调整合成HKUST-1@MIPs过程中加入HKUST-1的量，确保HKUST-1@MIPs表面的聚合物层能够布满HKUST-1的表面，而且厚度较薄。若合成的HKUST-1@MIPs表面的聚合物层太厚，则吸附位点不能分布在HKUST-1的表面，影响HKUST-1@MIPs的吸附量和解吸速率；若合成的HKUST-1@MIPs表面的聚合物层不能完全布满HKUST-1的表面，使HKUST-1裸露出来，则会影响HKUST-1@MIPs的吸附能力。将本发明合成的表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs作为自制柱填料，应用于样品中毒素的分离与分析，对小麦样品进行前处理实验，分析发现，本发明自制柱均可以良好的选择性吸附黄曲霉毒素，在选择性和吸附能力方面，本发明自制柱对黄曲霉毒素的效果表现更好。HKUST-1@MIPs对黄曲霉毒素的吸附量6.0μgmg-1。对比本发明自制柱、免疫亲和柱和商品固相萃取柱对小麦中黄曲霉毒素的处理效果，结果表明：本发明自制柱对含有黄曲霉毒素的实际样品具有更好的处理效果。对比表面印迹聚合物和印迹聚合物的吸附性能，吸附速率的测定结果表明，本发明表面印迹聚合物的吸附速率能在5min内就能达到吸附平衡，较快的传质速度有利于固相萃取柱对样品的处理。HKUST-1@MIPs柱的萃取线性范围是0.5μgkg-1-20μgkg-1，R2＝0.9991-0.9996，黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1的检出限分别为0.05μgkg-1，0.02μgkg-1，0.03μgkg-1和0.05μgkg-1；定量限分别为0.2μgkg-1，0.1μgkg-1，0.15μgkg-1和0.3μgkg-1。黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的加标回收率为92.5％-118.4％，相对标准偏差范围为3.14％-6.03％。该方法可靠和可行，方便快捷且灵敏高效，可以用来替代传统的免疫亲和柱处理分析方法。本发明创新点：以7-乙酰氧基-4-甲基香豆素为替代模板，能够降低成本，排除模板泄漏问题，提高检测结果的准确性；以金属有机骨架HKUST-1为载体，载体材料比表面积高，疏松多孔，结构稳定，聚合物能够接枝在载体表面；采用表面印迹技术，利用配位作用和共价键作用，将聚合物接枝在载体表面，而不是简单的包裹在载体表面，接枝的方法能够使载体与聚合物更加牢固的结合，不易使聚合物层从载体表面脱落，能更好的用于实际样品富集；合成表面印迹聚合物比表面积高、传质速率快，洗脱速率较快、重复使用性好；将此方法结合高效液相-荧光检测器，为小麦中黄曲霉毒素的分离、分析与检测提供了一种新的低成本、低耗时以及高灵敏的检测方法。附图说明图1为HKUST-1和HKUST-1@MIPs的SEM图；其中，A、B：HKUST-1的SEM图；C、D：HKUST-1@MIPs的SEM图；图2为HKUST-1和HKUST-1@MIPs的XRD图；图3为HKUST-1、HKUST-1@NIPs和HKUST-1@MIPs的ATR-FT-IR图；图4为HKUST-1@MIPs的吸附性能对比；A：HKUST-1@MIPs和HKUST-1@NIPs的等温吸附曲线；B：HKUST-1@MIPs和MIPs的吸附速率曲线；C：朗格缪尔吸附等温方程拟合曲线；D：伪二级动力学方程拟合曲线；图5为HKUST-1@MIPs固相萃取柱的重复使用性柱状图；图6为实际样品检测结果对比图；A：未加标大豆；B：加标大豆；C：未加标大米；D：加标大米；E：未加标花生；F：加标花生；G：未加标小麦；H：加标小麦；I：未加标玉米；J：加标玉米；图7为自制柱和免疫亲和柱检测结果对比图；A：AFs标样的高效液相色谱图；B：经AFs免疫亲和柱处理过的加标样品的高效液相色谱图；C：HKUST-1@MIPs固相萃取柱处理过的加标样品的高效液相色谱图。具体实施方式为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：实施例11HKUST-1的合成取3.15g15mmol二三氯甲基碳酸酯BTC，加入75mL乙醇，超声，至BTC完全溶解。准确称取6.05g25mmolCuNO32·3H2O于另一烧杯中，加入75mLH2O，超声，至CuNO32·3H2O完全溶解。混合两只烧杯中的溶液，磁力搅拌20min，倒入水热反应釜，120℃下反应12h，过滤，使用乙醇洗涤三次，除去未反应的BTC，再用水洗涤三次，除去未反应的CuNO32·3H2O，过滤，150℃下烘干，得到紫色固体，即为脱水后的HKUST-1。2HKUST-1@MIPs的合成准确称取0.0654g0.3mmol7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入0.1518mL1.8mmolα-MAA、2.2656mL12mmolEGDMA，再加入0.04gAIBN，超声10min后移至三口瓶中，加入乙醇，在80℃下磁力搅拌5h，将得到的产物置于烘箱中干燥。表面非印迹聚合物HKUST-1@NIPs的合成过程如HKUST-1@MIPs不加模板。通过图1可以看到合成的AFs表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs的微观结构及表面情况，图A和B是HKUST-1的SEM图，图C和D是HKUST-1@MIPs的SEM图。对比HKUST-1@MIPs和HKUST-1的SEM图可以看出：HKUST-1@MIPs和HKUST-1的表面结构具有较大差异，在SEM镜头下，HKUST-1结构整齐，为正八面体结构，颗粒大小在20μm左右，表面光滑；HKUST-1@MIPs的颗粒大小与HKUST-1相同，表面可以明显看到聚合物层，聚合物层的厚度较薄，没有影响载体的整体外形，与HKUST-1外形相同，接枝聚合物后，HKUST-1@MIPs也为正八面体结构，但是表面具有聚合物层，结构疏松。若使用简单的物理包裹的方法将聚合物包裹在载体HKUST-1表面，载体表面的聚合物容易在脱落。而利用MAA和EGDMA与HKUST-1中心离子Cu2+的配位作用将聚合物接枝到HKUST-1的表面，聚合物与HKUST-1结合更为牢固，结构更为稳定，不会在操作过程中造成聚合物与HKUST-1分离。聚合物接枝到HKUST-1的表面上之后，外观发生变化，造成HKUST-1@MIPs和HKUST-1在扫描电镜下呈现不同的外观。可以说明MIPs接枝到了HKUST-1的表面，成功合成了AFs表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs。3HKUST-1@MIPs的表征取少量合成的HKUST-1和HKUST-1@MIPs，使用XRD进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在HKUST-1前后聚合物的差别。见图2。由图可知，HKUST-1@MIPs的特征衍射峰与HKUST-1的衍射峰相同，说明HKUST-1和HKUST-1@MIPs具有部分相同结构，合成HKUST-1@MIPs之后，HKUST-1的晶体结构没有遭到破坏。HKUST-1的XRD谱图的峰高要高于HKUST-1@MIPs的XRD谱图的峰高。造成这一现象的原因可能是由于MIPs聚合到HKUST-1表面上之后，影响了X射线的衍射，从而使HKUST-1和HKUST-1@MIPs的X射线衍射光强度不同，证明了AFs表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs的成功合成。取少量合成的HKUST-1、HKUST-1@NIPs和HKUST-1@MIPs，使用ATR-FT-IR进行表征，分析谱图，对比MIPs接枝在HKUST-1前后聚合物所含官能团的差异。确定MIPs已接枝在HKUST-1表面。见图3。由图可知，HKUST-1、HKUST-1@NIPs和HKUST-1@MIPs的ATR-FT-IR光谱：HKUST-1在3350cm-1处的吸收峰来自BTC的羟基基团，1370cm-1和1453cm-1处的吸收峰来自BTC的C-O和C＝O。HKUST-1@NIPs和HKUST-1@MIPs的ATR-FT-IR图的特征峰相同，HKUST-1@MIPs已不含有7-乙酰氧基-4-甲基香豆素。HKUST-1@MIPs和HKUST-1@NIPs在1739cm-1和1150cm-1这两处都有吸收峰，分别来自MAA和EGDMA的C＝O双键的伸缩振动和EGDMA的C-O-C的不对称伸缩振动，而HKUST-1在这两处没有吸收峰，说明MAA和EGDMA在HKUST-1表面进行了聚合反应。而且，HKUST-1和HKUST-1@MPS的特征吸收峰也出现在HKUST-1@MIPs的ATR-FT-IR光谱图中。结果表明，在引发剂的作用下，单体α-MAA和交联剂EGDMA在HKUST-1表面进行聚合反应，MIPs接枝到了HKUST-1的表面，成功合成AFs表面印迹聚合物HKUST-1@MIPs。应用例11实际样品的制备大米，花生，小麦，大豆和玉米样品皆从当地超市购买。使用粉碎机将样品打成粉末，过筛80目。取5.0±0.1g的样品，加20mL的乙腈水84:16，vv溶液，振摇20min，玻璃纤维滤纸过滤。取4mL过滤后的溶液，并加入46mL1％的Tween-20PBS缓冲溶液，将AFs标准溶液加入样品中可配置不同浓度的上样溶液。2自制柱净化准确称取200mgHKUST-1@MIPs用于制备分子印迹固相萃取柱。用10mL甲醇对分子印迹固相萃取柱进行活化，再用10mL蒸馏水洗去甲醇以避免甲醇将目标毒素带出而造成对目标毒素浓度的影响。取10mL玉米实际样品提取液上样。之后用10mL水淋洗以洗去杂质。最后用2mL色谱级甲醇洗脱，收集洗脱液，N2下吹干，2mL流动相溶解，用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。3免疫亲和柱净化取免疫亲和柱，等柱内液体流完后，用50mL1ngmL-1的实际样品提取液上样，10mL水淋洗，2mL甲醇洗脱。用滤膜过滤，使用HPLC-FD检测溶液浓度。4HKUST-1@MIPs的吸附性能通过等温吸附实验和吸附速率实验对HKUST-1@MIPs的吸附性能进行检测，并使用朗格缪尔吸附等温方程和伪二级动力学方程研究HKUST-1@MIPs的吸附机理。如图4的A图所示，使用1μgmL-1至100μgmL-1的不同浓度的AFs溶液测定HKUST-1@MIPs和HKUST-1@NIPs对AFs的吸附能力。结果表明，随着AFs浓度的增加，两种聚合物对AFs的吸附量都增加。在100μgmL-1的浓度下，HKUST-1@MIPs和HKUST-1@NIPs对AFs的最大吸附量分别超过42.11μgmg-1和17.94μgmg-1。显然，实际样品当中几乎不可能含有高于此浓度的AFs，说明HKUST-1@MIPs完全适用于实际样品中AFs的富集。HKUST-1@MIPs对AFs的吸附量比HKUST-1@NIPs大得多，表明HKUST-1@MIPs对AFs具有较好的吸附能力，HKUST-1@NIPs对AFs的吸附能力较弱，因为HKUST-1@NIPs对AFs只有非特异性物理吸附，吸附量较小。不同于HKUST-1@NIPs对AFs的非特异性物理吸附，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附是通过HKUST-1@MIPs表面的特异性识别位点产生，具有特异性吸附AFs的能力。HKUST-1@MIPs表面的特异性识别位点的尺寸和几何结构与AFs的尺寸和几何结构是互补，而且特异性识别位点表面会与AFs的官能团形成氢键作用，对AFs具有较强的吸附能力。因此，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附量高于HKUST-1@NIPs。如图4的B图所示，用10μgmL-1AFs溶液检测HKUST-1@MIPs和MIPs的吸附速率。HKUST-1@MIPs对AFs的吸附在5分钟内达到吸附平衡，吸附量为6.0μgmg-1，显示了表面印迹聚合物对AFs的快速吸附能力。是由于HKUST-1@MIPs的比表面积较大，而且HKUST-1@MIPs对AFs的特异性识别位点大多位于HKUST-1@MIPs的表面或近表面，因此在AFs接触HKUST-1@MIPs表面即被吸附，达到快速吸附效果。而MIPs对AFs的吸附在10分钟左右才达到吸附平衡，是由于其大部分识别位点位于聚合物内部，位于MIPs内部的特异性识别位点对AFs的吸附需要更长的时间。因此，MIPs对AFs的吸附要达到吸附平衡需较长的时间，HKUST-1@MIPs具有比MIPs更高的吸附速率。在对含有AFs的实际样品的预处理过程中，使用HKUST-1@MIPs能够节省较多的时间，有助于提高样品预处理效率，减小实验误差。如图4的C图所示，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附符合朗格缪尔等温吸附模型，具有较高R2值0.9970。可以表明，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附是近似于单分子层吸附，对AFs的吸附过程发生在HKUST-1@MIPs表面或者内部特定的均匀点上，说明HKUST-1@MIPs表面的聚合物层较薄，对AFs的吸附近乎发生在聚合物层的表面，而不是深入到内部。因此，HKUST-1@MIPs的吸附速率要高于MIPs，而且HKUST-1@MIPs上的聚合物层分布在HKUST-1的表面，聚合物层能够完全用于吸附AFs，而MIPs球体内部却无法用于吸附AFs或者吸附量很低，所以MIPs对AFs的吸附能力要弱于HKUST-1@MIPs。如图4的D图所示，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附较为符合伪二阶动力学模型，具有较高R2值0.9997。可以表明，HKUST-1@MIPs对AFs的吸附过程中可能存在化学作用，而不单是物理吸附，说明HKUST-1@MIPs具有与AFs结构、大小类似的由含有羟基的α-MAA和EGDMA组成的吸附位点，当AFs进入到HKUST-1@MIPs的聚合物层，吸附位点上的羟基与AFs的羰基形成氢键，将AFs牢固的保留在HKUST-1@MIPs表面的聚合物层。与HKUST-1@NIPs的物理吸附相比，HKUST-1@MIPs的化学吸附对AFs具有更好的吸附能力：吸附速率更快，吸附量更大。4重复使用性HKUST-1@MIPs的重复使用性是影响其应用价值的关键因素之一。为检测HKUST-1@MIPs的重复使用性，在同一支HKUST-1@MIPs固相萃取柱上重复六次活化、上样、淋洗和洗脱步骤。如图5所示，随着重复洗脱次数的增加，HKUST-1@MIPs固相萃取柱对AFs的回收率逐渐降低，但降低的速率较慢，而且在第六个循环的回收率仍大于95％。结果表明，HKUST-1@MIPs固相萃取柱对AFs的吸附洗脱具有较高的稳定性和可重复使用性，若将HKUST-1@MIPs固相萃取柱用于含有AFs样品的前处理可以节约检测成本，具有较好的实用价值。应用例2方法评价参考国家标准对食品中AFs的限量，以样品基质液为溶剂，AFs为溶质，配置一系列浓度的溶液，过HKUST-1@MIPs固相萃取柱，收集洗脱液进高效液相色谱仪进行检测。如表1所示，四种毒素的标准曲线线性范围为0.5μgkg-1-20μgkg-1，R2＝0.9991-0.9996，线性良好，可用于对AFs的含量进行定量计算。AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的检出限分别为0.05μgkg-1，0.02μgkg-1，0.03μgkg-1和0.05μgkg-1；定量限分别为0.2μgkg-1，0.1μgkg-1，0.15μgkg-1和0.3μgkg-1。检出限和定量限都远低于国家对食品中AFs的限量，HKUST-1@MIPs柱结合高效液相色谱-荧光检测器的方法可用于食品中AFs的检测。表1四种AFs检测方法的检出限、定量限和线性范围为验证方法的可靠性，对四种AFs进行加标回收实验。根据优化好的HKUST-1@MIPs固相萃取柱的固相萃取条件，设定1μgkg-1、5μgkg-1和10μgkg-1三个加标浓度，进行加标回收实验，并计算RSD。表2四种AFs的加标回收率表3方法的精密度由表2和表3可以得知：在1μgkg-1、5μgkg-1和10μgkg-1加标浓度下，四种AFs的加标回收率为92.5％-118.4％，RSD范围为3.14％-6.03％。对四种AFs在三个浓度水平的加标回收率的相对标准偏差均小于国家标准方法中规定的15％，说明HKUST-1@MIPs固相萃取柱用于食品中四种AFs的检测具有较好的回收率和准确度，可用于实际样品中AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的分析检测。应用例3实际样品检测为进一步验证HKUST-1@MIPs固相萃取柱能够应用于实际样品的分析检测，取在室温下放置一个月的小麦、大米、玉米、花生和大豆样品作为实际样品，过HKUST-1@MIPs固相萃取柱，进HPLC-FD进行检测。由图6可以看出：小麦、大米、玉米、花生和大豆样品在适宜条件下存放，可能产生AFs，不同样品产生的AFs的种类、含量也并不相同。大豆样品检测出AFG1，AFB2，AFB1；大米样品检测出AFG2，AFG1，AFB2；花生样品检测出AFG2，AFG1；小麦样品检测出AFG1，AFB2；玉米样品检测出AFG1，AFB2。加标前后，不同种类的AFs对应的色谱峰高度明显不同，加标后AFs的色谱峰增高。说明未加标样品的色谱图中，与加标样品色谱图对应的AFs色谱峰并不是杂质峰，而是未加标样品本身就含有AFs，经过HKUST-1@MIPs柱的富集，在高效液相色谱图中显示出来，证明了HKUST-1@MIPs固相萃取柱能够有效地萃取实际样品中的AFs，不仅能够萃取加标样品中含量较高的AFs，也能够萃取未加标样品中含量较低的AFs，可用于不同种类的AFs、不同AFs含量的实际样品检测。对比例1自制柱与免疫亲和柱对比为进一步验证HKUST-1@MIPs固相萃取柱在食品中AFs的分析检测中的实际应用价值，由图7的C可知：色谱图中对应四种毒素的色谱峰峰形较好，可将四种AFs完全分离，可定性也可定量分析。对比图7的B和图C可以发现：HKUST-1@MIPs固相萃取柱和AFs免疫亲和柱对实际样品中的AFs均有较好的萃取能力，两种萃取柱对AFG2和AFB2萃取能力相差无几，但相比于AFs免疫亲和柱，HKUST-1@MIPs固相萃取柱对AFG1和AFB1有更好的萃取效果。而且HKUST-1@MIPs固相萃取柱生产成本较低，价格低廉，能够重复使用，结构稳定且易保存，应用前景广泛。

权利要求：1.一种黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成：将HKUST-1超声分散于无水乙醇中，称取7-乙酰氧基-4-甲基香豆素，加入单体α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入偶氮二异丁腈，超声后移至反应瓶中，加入乙醇，加热磁力搅拌，将得到的产物置于烘箱中干燥得目标物。2.如权利要求1所述的黄曲霉毒素表面印迹聚合物，其特征在于，模板分子7-乙酰氧基-4-甲基香豆素与α-甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为：1:6:40，反应温度80℃。

百度查询： 河南工业大学;河南水利与环境职业学院 基于HKUST-1的黄曲霉毒素表面印迹聚合物及其应用

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