申请/专利权人：中南大学湘雅医院

申请日：2016-05-30

公开（公告）日：2019-10-22

公开（公告）号：CN105803108B

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.10.22#授权;2016.08.24#实质审查的生效;2016.07.27#公开

摘要：本发明提供与慢性荨麻疹的发病易感的人ORAI1基因的单核苷酸多态性位点及其制备的检测制剂。尤其是提供了人ORAI1基因rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT单核苷酸多态性位点作为检测慢性荨麻疹以及慢性荨麻疹患者治疗的药物靶点，据此针对性用药，提高疾病治疗的有效率，更好地改善他们的生活质量；同时对其发病进行预测。

主权项：1.ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，所述的ORAI1基因多态性位点具体为rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT。

全文数据：与慢性荨麻疹易感性相关的ORAI1基因多态性位点及其检测制剂技术领域本发明属于分子生物学和医学领域。涉及与慢性荨麻疹易感性相关的人ORAI1基因的单核苷酸多态性位点及其用途。具体涉及人ORAI1基因与慢性荨麻疹易感性以及第二代抗组胺药物治疗慢性荨麻疹疗效相关的多态性位点。本发明还涉及检测这些多态性位点的制剂。背景技术慢性荨麻疹是一种常见的、以风团伴不同程度瘙痒为主要表现的免疫性皮肤疾病，病程超过6周，11％-14％可达5年以上，需长期用药干预。慢性荨麻疹还不同程度地降低学习和工作效率，影响患者生活质量。慢性荨麻疹还是一种多基因遗传病，部分患者具有遗传背景,有10％-20％的患者疾病可能遗传给后代。肥大细胞是荨麻疹发病机制中主要的效应细胞，在各型荨麻疹的发病中发挥着中心作用。近来研究不断证实钙释放激活的钙通道Ca2+release-activatedCa2+channels，CRAC不仅能够介导多种受体包括免疫性和非免疫性受体诱导的荨麻疹肥大细胞活化，还能在其脱颗粒、合成炎症介质和脂类代谢物等一系列生物学效应中发挥关键作用。但目前尚无研究报道ORAI1基因与慢性荨麻疹易感性以及第二代抗组胺药物治疗慢性荨麻疹疗效的相关性。发明内容本发明的目的是提供与慢性荨麻疹的发病易感的人ORAI1基因的单核苷酸多态性位点及其制备的检测试剂。本发明与慢性荨麻疹易感性相关的ORAI1基因多态性位点，具体为rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT。ORAI1基因SNP位点rs3741596AG，其A等位基因正向调控肥大细胞内钙离子浓度，从而增加慢性荨麻疹的发病风险；如果是G等位基因，则降低慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12313273TC，其T等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是C等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs3741595CT，其C等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是T等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12320939GT，其G等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是T等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险。本发明所述的与慢性荨麻疹易感性相关的ORAI1基因多态性位点的检测制剂，包括：Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的制剂。PCR检测试剂盒包括慢性自发性荨麻疹患者外周血全基因组DNA和特异性扩增ORAI1基因不同SNP位点的引物，以及rTaq酶，去离子水。特异性扩增ORAI1基因不同SNP位点的引物，序列如下：扩增rs3741595,rs3741596位点:正义链:5-agggtcccagagcctgac-3；反义链：5-aatcctcttccctccatgct-3，扩增长度为831bp；扩增rs12313273与rs12320939位点：正义链：5-ttcaccccgccaaccggcaatgtcacatgc-3；反义链：5-aggacgaggtcgaagaagtg-3，扩增片段长度为2094bp。本发明与第二代抗组胺药物治疗慢性荨麻疹疗效相关的ORAI1基因多态性位点rs3741595CT。携带T等位基因患者抗组胺药物疗效优于携带C等位基因患者。本发明与第二代抗组胺药物治疗慢性荨麻疹疗效的相关的ORAI1基因多态性位点的检测制剂，包括：Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的制剂。本发明发现和证明了ORAI1基因rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT与慢性荨麻疹的发病易感性相关由表1数据可以看出，患者与正常人相比携带不同等位基因频率存在统计学差异，P值均小于0.05；而且还进一步发现了ORAI1rs3741595CT与第二代抗组胺药物的疗效相关由表2数据得知。本发明所述的ORAI1基因的详细序列可参见ENSEMBLE数据库核苷酸序列可参见网址http:www.ncbi.nlm.nih.govgene84876，全长20kbpgeneID:84876；LOCATION:Chromosome12,NC_000012.12121626550..121642040。本发明提供的PCR试剂盒包括慢性自发性荨麻疹患者外周血全基因组DNA和特异性扩增ORAI1基因不同SNP位点的引物，以及rTaq酶，去离子水。其中所述20ul体系中，引物各1ul,模板2ul，rTaq酶10ul，去离子水补足。与本发明试剂盒配套的检测方法包括以下步骤：1关于多态性位点扩增方法：反应体系，条件如下：PCR扩增反应条件如下：预变性94℃5mim；循环94℃30S,58℃30S,72℃1min,35个循环，72℃延伸8min。本发明的试剂盒检测用引物如下：扩增rs3741595,rs3741596位点:正义链:5-agggtcccagagcctgac-3；反义链：5-aatcctcttccctccatgct-3，扩增长度为831bp；扩增rs12313273与rs12320939位点：正义链：5-ttcaccccgccaaccggcaatgtcacatgc-3；反义链：5-aggacgaggtcgaagaagtg-3，扩增片段长度为2094bp。本发明通过检测ORAI1基因的靶向SNP位点，可用于预测慢性荨麻疹发病风险。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。ORAI1基因的rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。通过本发明的检测还可以进行抗组胺药物疗效的判定，进而指导治疗。发明人通过研究发现ORAI1基因SNP位点rs3741595CT，携带T等位基因患者抗组胺药物疗效优于携带C等位基因患者。ORAI1基因SNP位点rs3741596AG，其A等位基因正向调控肥大细胞内钙离子浓度，从而增加慢性荨麻疹的发病风险；如果是G等位基因，则降低慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12313273TC，其T等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是C等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs3741595CT，其C等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是T等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12320939GT，其G等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；如果是T等位基因，则增加慢性荨麻疹的发病风险。本发明提供了人ORAI1基因rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT单核苷酸多态性位点作为检测慢性荨麻疹以及慢性荨麻疹患者治疗的药物靶点，据此针对性用药，提高疾病治疗的有效率，更好地改善他们的生活质量；同时对其发病进行预测。附图说明：图1：ORAI1rs12313273TC图1左，rs12320939GT图1右野生型与突变型荧光素酶报告基因水平；图2：Rs3741596不同等位基因对RBL-2H3细胞内钙离子浓度的影响；图2中排列在上面的一副图的横坐标是荧光通道标记的荧光强度，纵坐标为细胞数，数量级为10的1-7或1-7.2次方。具体实施方式：以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。1.将慢性自发性荨麻疹患者严格按照国际诊断标准入组，随机给药，同时在患者签署知情同意书的情况下采取外周血3ml，提取全基因组DNA进行飞行质谱芯片技术，对SNP进行检测。结果回报后进行生物信息学分析，结合以千人基因组计划中中国南方人群个位SNP位点分型资料为正常对照http:browser.1000genomes.orgindex.html，统计分析后发现rs12313273TC，rs12320939GT，rs3741596AG，rs3741595CT与慢性自发性荨麻疹易感相关；收集266例正常人，进行飞行质谱测序后对上述4个位点进行分型，将慢性荨麻疹患者及正常对照两组人群进行对比统计分析验证。表1：ORAI1SNPs位点多态性与慢性荨麻疹易感性的关联分析。2.将入组的慢性自发性荨麻疹患者191例治疗4周后进行疗效评估，UAS7评分下降大于50％认为有效，其中使用地氯雷他定患者114例。根据疗效将该114例患者分为两组：有效组81例，无效组33例。将不同疗效两组进行rs3741595SNP位点基因型及等位基因频率对比，统计分析。表2：ORAI1SNPs位点多态性与慢性荨麻疹疗效的关联分析。3.构建ORAI1基因rs12313273TC，rs12320939GT野生型及突变型PGL3载体，首先以人外周血全基因组DNA为模板，ORAI1特异性引物为扩增引物进行直接PCR扩增目的片段，然后利用胶回收法回收目的片段后进行PGL3-Basic空载体及目的片段KpnI和BglII双酶切，并以相应比例构建连接体系后16℃过夜连接后进行转化、挑菌摇菌并提质粒测序验证。体外瞬时转染构建成功的质粒与内参质粒PRL-TK，按0.7ug：0.1ug的比例转染入HEK293细胞中，24小时后收集细胞，检测各孔荧光素值，计算各孔萤火虫荧光与相应海肾荧光的值。用SPSS17.0软件对结果进行统计分析。荧光素酶基因活性结果证实，携带ORAI1多态性位点rs12312273C等位基因的载体启动子活性高于T等位基因载体的启动子活性。Rs12320939T等位基因的载体启动子活性高于G等位基因载体的启动子活性。参见图14.体外用电转的方法瞬时转染构建好的pCDNA4.0-AA和pCDNA4.0-GG载体至RBL-2H3细胞，以pCDNA4.0TOmy-His为空白对照，转染48h后用Fluo-4染料标记细胞内Ca2+，流式细胞检测仪FITC通道检测静息状态下胞内Ca2+浓度和TG刺激后胞内Ca2+浓度。结果显示：携带rs3741596不同等位基因在静息状态及TG刺激后细胞内Ca2+浓度差异显著，转染AA等位基因质粒细胞内Ca2+浓度明显高于转染了GG等位基因的质粒，P0.05。参见图2表1表2

权利要求：1.ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，所述的ORAI1基因多态性位点具体为rs3741595CT，rs3741596AG，rs12313273TC，rs12320939GT。2.根据权利要求1所述的ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，其特征在于：ORAI1基因SNP位点rs3741596AG，其A等位基因正向调控肥大细胞内钙离子浓度，从而增加慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12313273TC，其T等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs3741595CT，其C等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险；ORAI1基因SNP位点rs12320939GT，其G等位基因负性调控ORAI1基因的表达水平，从而降低慢性荨麻疹的发病风险。3.根据权利要求1或2所述的ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，其特征在于，所述的制剂为：Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的制剂。4.根据权利要求3所述的ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，其特征在于，所述的制剂为PCR检测试剂盒。5.根据权利要求4所述的ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，其特征在于，PCR检测试剂盒包括慢性自发性荨麻疹患者外周血全基因组DNA和特异性扩增ORAI1基因不同SNP位点的引物，以及rTaq酶，去离子水。6.根据权利要求5所述的ORAI1基因多态性位点检测试剂在制备检测慢性荨麻疹发病风险制剂中的应用，其特征在于，所述的特异性扩增ORAI1基因不同SNP位点的引物，序列为：扩增rs3741595,rs3741596位点:正义链:5-agggtcccagagcctgac-3；反义链：5-aatcctcttccctccatgct-3，扩增长度为831bp；扩增rs12313273与rs12320939位点：正义链：5-ttcaccccgccaaccggcaatgtcacatgc-3；反义链：5-aggacgaggtcgaagaagtg-3，扩增片段长度为2094bp。7.ORAI1基因多态性位点rs3741595CT检测试剂在制备预测地氯雷他定治疗慢性荨麻疹疗效制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的ORAI1基因多态性位点rs3741595CT检测试剂在制备预测地氯雷他定治疗慢性荨麻疹疗效制剂中的应用，其特征在于，携带T等位基因患者地氯雷他定疗效优于携带C等位基因患者。9.权利要求7或8所述的ORAI1基因多态性位点rs3741595CT检测试剂在制备预测地氯雷他定治疗慢性荨麻疹疗效制剂中的应用，其特征在于，为Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的制剂。

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