申请/专利权人：四川大学

申请日：2018-10-26

公开（公告）日：2020-01-10

公开（公告）号：CN109507418B

主分类号：G01N33/543(20060101)

分类号：G01N33/543(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.10.11#未缴年费专利权终止;2019.04.16#实质审查的生效;2019.03.22#公开

摘要：本发明公开了具有仿细胞结构的磁性纳米粒子、免疫磁性纳米粒子及其制备方法与应用。本发明具有仿细胞结构的磁性纳米粒子以超顺磁性Fe3O4纳米粒子作为内核，其表面包覆有白细胞膜，因此该磁性纳米粒子不仅表现出优异的磁响应性能，且其表面包覆的白细胞膜与白细胞具有同源性，可以有效减弱对白细胞的非特异性吸附；将抗体经脂质分子‑聚乙二醇‑生物素分子和亲和素的介导修饰到磁性纳米粒子表面包覆的白细胞膜上，得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，可实现对CTCs细胞高效率、高纯度的富集与分离。

主权项：1.具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，其特征在于是由Fe3O4磁性纳米粒子、依次包覆于Fe3O4磁性纳米粒子表面的高分子聚合物层、石墨烯层和白细胞膜层构成。

全文数据：具有仿细胞结构的磁性纳米粒子、免疫磁性纳米粒子及其制备方法与应用技术领域本发明属于仿生免疫磁性纳米材料技术领域，涉及具有仿细胞结构的磁性材料与制备方法以及该磁性材料在循环肿瘤细胞富集方面的应用。背景技术循环肿瘤细胞Circulatingtumorcells,CTCs是指从实体肿瘤脱落到血液循环中的肿瘤细胞，CTCs通过循环系统扩散至机体的其它组织或器官，在肿瘤转移和复发中起着重要作用。通过对CTCs的检测，可为癌症治疗、癌症转移和癌症预后等提供具有指示性的信息。因此，外周血中循环肿瘤细胞的检测具有重要的临床应用价值。然而，CTCs在血液中浓度极低1mL血液中仅含有一个至数十个CTCs，严重阻碍CTCs的计数及更深入的研究。目前，CTCs富集和分离技术按照其分离原理，可以分为两类：1基于CTCs与血液细胞的物理性质的差异，包括密度、尺寸、变形性等，如基于该分离原理设计的希二氏密度梯度离心溶液FicollHypaquedensitycentrifugation，微孔芯片MicroporeChip等；但是由于CTCs与血细胞的密度、尺寸及变形性等都有较大的重叠，所以基于物理性质差异富集得到的CTCs纯度较低；2基于CTCs与血液细胞表面带有不同的抗原，通过在分离基质上修饰该抗原对应的抗体或者适配子等，将CTCs从血液中富集及分离出来，如基于该分离原理设计的免疫磁分离平台如，CellSearch系统、CTC芯片、MagSweeper设备等。其中，免疫磁分离技术由于具有功能成分修饰方便、操作简单、捕获效率较高等优点，而受到广泛关注。虽然免疫磁分离技术很有前景，但由其抗白细胞吸收能力较差，导致富集样本中的CTC纯度较低，大大限制了CTCs的下游研究。例如，到目前为止，FDA唯一批准的CTCs分离平台——CellSearch系统富集的样本中，仍有数千个白细胞，CTCs的纯度仅为0.1～1.4％。为了在不影响捕集效率的前提下提高抗白细胞吸收性能，非离子型亲水聚乙二醇和与细胞膜结构相似的人造脂质双层被修饰在CTCs分离平台上。然而，结果并不像预期的那样令人满意，当只有较少数目的CTCs加入血样时，在富集后样本中仍有数十至数千个白细胞。随后，人们逐渐认识到，主要由蛋白质和磷脂双分子层组成的、能保护细胞免受外界环境的影响的天然细胞膜，可能是一种理想的能将材料伪装成同源细胞的材料。对于白细胞膜伪装后的平台，可能能够排斥血液中大量存在的，影响CTCs靶向的白细胞每毫升血液中约107个，从而创造一个有利于实现高纯度CTCs分离的环境。例如，Xiong等人先将细胞膜叠氮功能化，再提取细胞膜，并将细胞膜包覆在Fe3O4纳米团簇上，最后通过点击化学将二苯并辛基修饰的抗体连接上Xiongetcl.AdvancedMaterial2016,28,7929-7935.DOI:10.1002adma.201601643。Rao等人提取并融合白细胞膜和血小板膜，通过共挤出的方式将混合膜包覆在磁珠上，最后修饰上能特异性靶向CTCs的抗体Raoetcl.AdvancedFunctionalMaterials.2018,1803531.DOI:10.1002adfm.201803531。虽然这两种CTCs分离平台获得了良好的抗白细胞性能，但是为了提取目的膜组分，必须结合低渗透、机械破坏和一系列梯度离心等步骤，去除未破裂细胞和细胞内容物。此外，必须再通过超声和或多次机械挤压等手段才能将天然细胞膜组分与磁性颗粒整合在一起。总之，传统的细胞膜提取及细胞膜与磁纳米平台的整合过程所涉及的工艺复杂、周期长、并且还需要用到特殊的挤出机等设备。因此，亟需发展一种能够简便地实现细胞膜提取及其与磁性纳米粒子整合的方法。发明内容本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，通过磁性纳米粒子表面包覆的白细胞膜，增强磁性纳米粒子的抗白细胞吸附特性。本发明的另一目的旨在提供上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子制备方法。本发明的第三个目的旨在提供一种具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，实现对循环肿瘤细胞高效率、高纯度的富集和分离。本发明的第四个目的旨在提供一种具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子制备方法。本发明的第五个目的旨在提供上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子在富集循环肿瘤细胞中的应用。本发明提供的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，是由Fe3O4磁性纳米粒子、依次包覆于Fe3O4磁性纳米粒子表面的高分子聚合物层、石墨烯层和白细胞膜构成。该具有仿细胞结构的磁性纳米粒子以超高饱和磁化强度的Fe3O4纳米粒子为内核57.21emug-1，使得磁性纳米粒子整体饱和强度达到最终得到的50.27emug-1，具有较高的饱和磁化强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能所有磁纳米粒子，在2min以内，几乎能全部被磁铁吸附住。Fe3O4磁性纳米粒子外包覆的高分子聚合物层为过渡层，本发明中采用的高分子聚合物为聚丙烯胺盐酸盐或聚乙烯亚胺。这类高分子聚合物带正电，可用于实现对石墨烯的吸附。高分子聚合物层外包覆的石墨烯为羧基化石墨烯，且其为纳米片结构，可通过市场外购得到；该石墨烯能够插入到白细胞膜中，刮取大量磷脂分子，从而将白细胞膜吸附于Fe3O4磁性纳米粒子上。白细胞膜包覆的磁性纳米粒子，一方面由于其与白细胞具有同源性，而被白细胞排斥，非特异性白细胞吸附被显著抑制；另一方面，其生物相容性好，能在血液中较稳定地存在。因此上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子在修饰上相应的抗体或适配子等，可以用于复杂样本如全血，血清，人造全血等中靶向，富集及分离目标细胞、外泌体等。本发明进一步提供了上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的制备方法，其技术构思为通过在超顺磁性Fe3O4纳米粒子MNs表面修饰上能插入并从细胞膜中提取大量磷脂的石墨烯纳米片，从而快速获得白细胞膜包覆的磁性纳米粒子即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子简称BMNs。具体而言，首先在Fe3O4磁性纳米粒子表面通过层层自组装技术Layer-by-Layer，LbL依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层；由于石墨烯带负电，因此本发明以带正电的聚丙烯胺盐酸盐或聚乙烯亚胺等作为高分子聚合物层，将石墨烯通过静电作用包覆在Fe3O4磁性纳米粒子上。然后将自组装得到的磁性纳米粒子与白细胞孵育，获得白细胞包覆的磁性纳米粒子，相对于传统细胞膜提取方法，工艺简单、操作方便。具体实现方式中，该具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的制备方法步骤如下：1通过静电作用，在Fe3O4磁性纳米粒子表面依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层得到产物L1；2将产物L1与均匀分散有细胞的培养基混合均匀后于37℃、二氧化碳体积浓度5％条件下孵育1.5～2h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到白细胞膜包覆产物L1的磁性纳米粒子，即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子。上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的制备方法，步骤1的目的是通过静电吸附作用在Fe3O4磁性纳米粒子表面依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层，其具体实现方式步骤如下：11将均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液和高分子聚合物的水溶液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应1～3h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到包覆有高分子聚合物层的Fe3O4磁性纳米粒子，记为产物L11；所述反应体系中Fe3O4磁性纳米粒子与高分子聚合物的质量比为1:0.08-0.4；12将均匀分散有产物L11的悬浮液和均匀分散有石墨烯的悬浮液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应1～3h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到在Fe3O4磁性纳米粒子表面依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层得到产物L1；所述反应体系中产物L11与石墨烯的质量比为1:0.1-0.11。上述高分子聚合物为聚丙烯胺盐酸盐PAH或聚乙烯亚胺PEI，石墨烯为羧基化石墨烯，可通过市场外购得到。步骤11和12中所述均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液中Fe3O4的浓度为1～1.25mgmL，高分子聚合物的水溶液中高分子聚合物的浓度为1～2mgmL，均匀分散有产物L11的悬浮液中产物L11的浓度为0.25～0.33mgmL，分散有石墨烯的悬浮液中石墨烯的浓度为1～1.1mgmL。步骤11和12中的洗涤目的是去除未包覆在磁性纳米粒子表面的高分子聚合物、石墨烯原料，采用去离子水对所得固体产物进行洗涤即可。上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的制备方法，步骤2的目的是将白细胞膜包覆于产物L1的外表面，是通过将产品L1与细胞孵育得到。所采用的均匀分散有细胞的培养基是将细胞均匀分散的无血清培养基中得到，所述细胞来自小鼠单核巨噬细胞或人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞等。所述产物L1与培养基的质量体积比为1:2～3，质量以mg计，体积以mL计，每1mL培养基中细胞的个数至少为1×105个。所述细胞的制备过程为：将细胞在37℃、二氧化碳体积浓度5％条件下培养，待细胞融合率达到90％以上，消化得到小鼠单核巨噬细胞或人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞等细胞，将所得细胞用PBS缓冲液清洗2～3次后，最后将细胞分散在无血清的高糖型DMEMdulbecco'smodifiedeaglemedium培养基。步骤2的洗涤的目的是去除包覆于产物L1表面的白细胞膜以外的其它杂质，可直接采用去离子水洗涤8～20次即可。上述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的制备方法，步骤1～2中的反应是在振荡条件下进行，振荡操作所采用的振荡器的转速为300～450转分钟。本发明进一步提供了一种具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，是通过在组成所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的白细胞膜上插入脂质分子-聚乙二醇-生物素分子，再修饰亲和素，最后修饰抗体得到。本发明所述脂质分子-聚乙二醇-生物素分子为：单酰基脂质C18-聚乙二醇-生物素C18-PEG2000-Biotin、胆固醇-聚乙二醇-生物素cholesterol-PEG2000-Biotin或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素DSPE-PEG2000-Biotin；所述亲和素为链霉亲和素或抗生物素蛋白Avidin；抗体为生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM-Biotin。该仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子由于修饰有anti-EpCAM-Biotin抗体，可实现对循环肿瘤细胞的特异性靶向，而白细胞膜可抑制对白细胞非特异性吸附，从而大大提高富集循环肿瘤细胞的纯度。本发明进一步提供了上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备方法，为了简单、快速、高效地引入脂质分子-聚乙二醇-生物素分子及抗体，首先基于脂质分子-聚乙二醇-生物素分子中脂质分子与白细胞膜中的磷脂双分子层相似，利用疏水作用，将脂质分子-聚乙二醇-生物素分子插入白细胞膜中，从而成功的在磁性纳米粒子上修饰上具有抗非特异性吸附的聚乙二醇，以及用于后续抗体引入的生物素。再在生物素上结合亲和素，便于后续能特异性靶向CTCs的抗体修饰，获得仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs。具体实现方式中，该具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备方法步骤如下：31将所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子与含脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应2～5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到产物L31；所述反应体系中具有仿细胞结构的磁性纳米粒子与脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的质量比为5000：1～3；32将产物L31与含亲和素的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应2～5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到产物L32；所述反应体系中产物L31与亲和素的质量比为5000：1～3；33将产物L32与含抗体的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下于4～7℃反应6～12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子；所述反应体系中产物L32与抗体的质量比为1000：0.5～1.5。上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备方法，所述脂质分子-聚乙二醇-生物素分子为：单酰基脂质C18-聚乙二醇-生物素C18-PEG2000-Biotin、胆固醇-聚乙二醇-生物素cholesterol-PEG2000-Biotin或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素DSPE-PEG2000-Biotin；所述含脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的PBS缓冲液中脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的浓度为10～30μgmL；所述亲和素为链霉亲和素或抗生物素蛋白Avidin等，所述含亲和素的PBS缓冲液中亲和素的浓度为10～30μgmL；抗体为生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体生物素修饰的anti-EpCAM-Biotin，含抗体的PBS缓冲液中抗体浓度为0.25～0.75μgμL。步骤31-33中的洗涤目的是去除修饰到白细胞膜包覆的磁性纳米粒子表面的生物素、亲和素和抗体，采用去离子水对所得固体产物进行洗涤即可。上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备方法，为了减少对目标细胞以外细胞的非特异性吸附，将免疫磁性纳米粒子与牛血清蛋白在PBS缓冲溶液中共孵育，以减少非特异性吸附。具体实现方式为：步骤33中，对所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子进行以下后处理：将所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs分散于牛血清蛋白质量浓度为0.5％-1.0％的PBS缓冲液中，在振荡条件下于4～7℃反应20～30min，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤，即完成对具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的后处理。这里对固体产物进行洗涤的目的在于去除所得产物表面的多余牛血清蛋白，采用去离子水对所得固体产物进行洗涤即可。对处理后的BIMNs重悬于PBS缓冲液中，并置于4～7℃下保存备用。上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备方法，步骤31～33中的反应是在振荡条件下进行，振荡操作所采用的振荡器的转速为300～450转分钟。上述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子在富集循环肿瘤细胞中的应用，该免疫磁性纳米粒子可以用于循环肿瘤细胞高效、高纯度富集和分离。上皮细胞粘附分子EpCAM和细胞角蛋白家族成员CK8、CK18和CK19在上皮型肿瘤细胞上存在，血细胞上却不存在；因此，上皮细胞粘附分子EpCAM和细胞角蛋白家族成员CK8、CK18和CK19已经成为检测上皮表型患者CTCs的“金标准”；因此修饰有anti-EpCAM抗体的免疫磁性纳米粒子，能特异地靶向并结合CTCs细胞。而磁性纳米粒子表面包覆的白细胞膜可抑制对白细胞非特异性吸附，从而大大提高循环肿瘤细胞的富集纯度。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明提供的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，由于以超顺磁性Fe3O4纳米粒子作为内核，其表面包覆有白细胞膜，因此该磁性纳米粒子不仅表现出优异的磁响应性能，且其表面包覆的白细胞膜与白细胞具有同源性，可以有效减弱对白细胞的非特异性吸附，该磁性纳米粒子可适用于复杂样本如全血，血清，人造全血等中靶向、富集及分离目标细胞、外泌体等。2、本发明提供的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子制备过程中，利用包覆在Fe3O4磁性纳米粒子表面的石墨烯与磷脂间的色散相互作用，可实现对白细胞膜的快速提取，获得白细胞膜包覆的磁性纳米粒子。3、本发明提供的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，将抗体经脂质分子-聚乙二醇-生物素分子和亲和素的介导修饰到磁性纳米粒子表面包覆的白细胞膜上，该免疫磁性纳米粒子不仅可以对CTCs细胞具有较高的富集效率，而且由于白细胞膜对同源白细胞非特异性吸附的有效抑制，大大提高了富集的CTCs细胞的纯度纯度高达96％以上，对CTCs的下游研究，如体外培养、扩增及高纯度的DNA、RNA及蛋白质的提取方面具有十分重要的意义。4、本发明提供的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，利用脂质分子-聚乙二醇-生物素分子中脂质分子与白细胞膜的相互疏水作用，可将脂质分子-聚乙二醇-生物素快速修饰到包覆白细胞膜的磁性纳米粒子表面，聚乙二醇具有抗非特异性吸附功能，生物素为后续特异性靶向CTCs的抗体的快速修饰奠定基础。5、本发明提供的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，可以在短时间约5min内完成对CTCs细胞的富集和分离，从而确保富集的CTCs具有较高的活性，有助于CTCs的下游研究。6、本发明提供的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子及免疫磁性纳米粒子制备方法，工艺简单、反应条件温和，在临床试验及应用方面具有极大的潜在价值，适于在生物医药领域内推广使用。附图说明图1为本发明实施例1制备的磁性纳米粒子由透射电镜检测得到的形貌表征图；其中，B、D、F、H分别为实施例1制备的PEI包覆的磁性纳米粒子MNs@PEI、石墨烯包覆的磁性纳米粒子MNs@PEI@G、白细胞膜包覆的磁性纳米粒子BMNs以及白细胞膜包覆的免疫磁性纳米粒子BIMNs的TEM图标尺为100μm，A、C、E、G分别为对应的放大图标尺为20μm。图2为本发明实施例1制备具有仿细胞结构的磁性纳米粒子过程中的粒子表面电位变化图。图3为本发明实施例1制备的磁性纳米粒子在488nm激光激发下的共聚焦图及SDS-PAGE图标尺为10μm；其中A为MNs@PEI@G与荧光染料DiO预染的J774A.1细胞孵育所得材料在488nm激光激发下的共聚焦图，B为细胞总蛋白Cell、细胞膜蛋白M、具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs所含白细胞膜蛋白的SDS-PAGE考马斯蓝染色图，C为修饰有DSPE-PEG2000-Biotin的磁性纳米粒子与异硫氰酸荧光标记链霉亲和素FITC-SA共孵育后所得磁性纳米粒子在488nm激光激发下的共聚焦图，D为仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs与异硫氰酸荧光素标记的驴抗山羊抗体孵育所得磁性纳米粒子在488nm激光激发下的共聚焦图。图4为本发明实施例1制备的磁性纳米粒子磁性能表征图；其中A为Fe3O4磁性纳米粒子和实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs在室温条件下测得的磁滞回线，B为不同浓度BIMNs水溶液在600nm处的紫外吸收谱图，C为永磁体富集BIMNs的时间-效率图。图5为应用例1中采用实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs对CTCs细胞捕获效果图；其中，A为BIMNs对CTCs细胞捕获效率随BIMNs浓度变化的柱状图，B为BIMNs对CTCs细胞捕获CTCs细胞捕获效率随孵育时间变化的柱状图，C为BIMNs和未修饰抗体的BIMNs，在最佳浓度及最佳孵育时间下对不同种类细胞的捕获效率。图6为应用例2中采用实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs在不同体系中检测限及平均检测效率表征示意图。图7为应用例3中采用实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs与美天旎商用磁珠在由MCF-7细胞与Jurkat细胞个数比：1:1，MCF-7细胞预先染成红色，Jurkat细胞染成绿色组成的样本中，两者抗白细胞吸附能力比较效果示意图；其中A为用美天旎商用磁珠捕获后所得产物在激光激发下的共聚焦叠加图标尺为50μm，B为用BIMNs捕获后所得产物在激光激发下的共聚焦叠加图标尺为50μm，C为MCF-7细胞捕获前后纯度柱状图。图8为应用例4中采用实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs从分散有MCF-7细胞的全血中，富集得到的典型MCF-7细胞及非特异性捕获到的白细胞的三色细胞免疫染色共聚焦图标尺为10μm。图9为应用例5中采用实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs与美天旎商用磁珠在含MCF-7细胞的去除红细胞血液和含MCF-7细胞的全血模拟样本中抗白细胞细胞吸附能力比较效果示意图；其中A、D为用美天旎商用磁珠在两种血液样本中捕获所得产物在激光激发下的共聚焦叠加图标尺为50μm，B、E为BIMNs在两种血液样本中捕获所得产物在激光激发下的共聚焦叠加图标尺为50μm，C、F为用美天旎商用磁珠和BIMNs在两种血液样本中捕获MCF-7细胞的捕获效率及捕获纯度柱状图。图10为应用例6中MCF-7细胞死活染色共聚焦图标尺为100μm，其中A为实验组中实施例1制备的仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs富集捕获的MCF细胞死活染色共聚焦图，B为对照组未经富集捕获过程的MCF细胞死活染色共聚焦图。图11为图10中实验组富集的MCF-7细胞体外培养图，其中A、B、C为第一代细胞培养阶段4h、24h、48h的培养效果图，D、E、F分别为第一次传代、第二次传代、第三次传代阶段中融合率达到90％左右时的培养效果图标尺为100μm。具体实施方式以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。为使本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细的说明和解释。以下实施例中采用的Fe3O4磁性纳米粒子的具体制备过程为：将原料1.157g六水合氯化铁、3.303g醋酸铵和0.4g柠檬酸钠加入到盛有60mL乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1～3h使上述原料混合均匀后，移除搅拌子，将反应釜放入加热炉中，升温至200℃，反应16小时后，关掉加热炉电源，将反应釜在加热炉中保温1小时再将反应釜取出。待反应釜冷却至室温后，对反应液进行磁分离1h以上并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇和去离子水对固体产物重复洗涤5次左右，至上清液完全澄清透明，所收集黑色磁性纳米粒子即Fe3O4磁性纳米粒子，将其置于4～7℃冰箱待用。通过上述方法得到的Fe3O4磁性纳米粒子可以很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。经分析，Fe3O4磁性纳米粒子粒径在300nm左右。以下实施例中振荡操作是在常规振荡器中完成的，所采用的振荡器的转速为300～450转分钟。以下实施例中采用的抗体为生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM-Biotin，该anti-EpCAM-Biotin抗体为市场外购，其厂家为R&DSystems，货号为BAF960。以下实施例中采用的石墨烯为羧基化石墨烯，为市场外购，其厂家为南京吉仓纳米科技有限公司，货号为JCG-1-50n-COOH，该羧基化石墨烯纳米片直径约为50nm，厚度约为0.8～1.2nm，约8％的碳原子被羧基化。实施例1本实施例具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步骤：1制备石墨烯和PEI包覆Fe3O4的磁性纳米粒子记为产物L1，MNs@PEI@G，包括以下分步骤：11将Fe3O4磁性纳米粒子MNs均匀分散到去离子水中，得到Fe3O4磁性纳米粒子浓度为1mgmL的悬浮液，将聚乙烯亚胺PEI溶解于去离子水中得到浓度为1.5mgmL的PEI水溶液；将5mL均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液和0.5mLPEI水溶液混合后，在振荡条件下反应2h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，即得到PEI包覆Fe3O4的磁性纳米粒子MNs@PEI，记为产物L11；12将产物L11均匀分散到去离子水中，得到产物L11浓度为0.33mgmL的悬浮液，将石墨烯均匀分散到去离子水中，得到石墨烯浓度为1mgmL的悬浮液；将15mL均匀分散有产物L11的悬浮液和0.5mL均匀分散有石墨烯的悬浮液混合后，在振荡条件下反应2h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次得到石墨烯包覆产物L11的磁性纳米粒子，即产物L1MNs@PEI@G；2制备具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs，包括以下分步骤：21将融合率达到90％的小鼠单核巨噬细胞J774.1，约2～3×106个利用细胞刮刀刮下，刮下的细胞用PBS缓冲液清洗3次后均匀分散到10mL高糖型无血清培养基DMEMGibco|LifeTechnologiesGrandIsland,USA中，得到均匀分散有细胞的培养基；22将5mg产物L1加入到均匀分散有细胞的培养基中混合均匀后于37℃、二氧化碳体积浓度为5％条件下孵育2h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤10次，得到白细胞膜包覆产物L1的磁性纳米粒子，即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs；3制备具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，包括以下步骤：31将DSPE-PEG2000-Biotin硕梵生物溶于PBS缓冲液中得到DSPE-PEG2000-Biotin浓度为20μgmL的PBS缓冲液；向5mg具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs中加入0.1mLDSPE-PEG2000-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下反应3h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L31；32将链霉亲和素阿拉丁，CAS号：9013-20-1，产品编号S103034溶于PBS缓冲液中得到链霉亲和素浓度为20μgmL的PBS缓冲液；向5mg产物L31中加入0.1mL链霉亲和素的PBS缓冲液，在振荡条件下反应3h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L32；33将生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体生物素修饰的anti-EpCAM-Biotin分散到PBS缓冲液中得到anti-EpCAM-Biotin浓度为0.5μgμL的PBS缓冲液；向5mg产物L32中加入10μLanti-EpCAM-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下于4℃反应10h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子；34将所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子分散于牛血清蛋白体积浓度为0.5％的PBS缓冲液中，在振荡条件下于4℃反应30min，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到后处理的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，并将其重悬于PBS缓冲液中，置于4℃冰箱内备用。对本实施例获得的产物进行形貌、微观结构和磁性能测试分析：1、形貌分析采用透射电子显微镜对磁性纳米粒子MNs@PEI、MNs@PEI@G、BMNs以及BIMNs进行形貌分析，得到的TEM形貌图如图1A-H所示。比较图1A和C可以看出，图1C中磁性纳米粒子表面多了对比度较低且呈薄片状的物质，说明石墨烯纳米片已成功修饰在磁性纳米粒子MNs@PEI表面。从图1E和F可以看出，磁性纳米粒子MNs@PEI@G与J774A.1细胞孵育后，该磁性纳米粒子表面覆盖一层对比度较小的晕，说明细胞膜被石墨烯刮下，获得了目标细胞膜包覆的磁性纳米粒子BMNs。从图1G和H看出，通过在磁性纳米粒子BMNs上进一步修饰能特异性靶向CTCs的生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM后，所得磁性纳米粒子BIMNs表面对比度较浅的晕变厚了，说明仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs被成功构筑。2、微观结构分析采用ZetasizerNanoZS90型粒度分析仪对磁性纳米粒子MNs、MNs@PEI、MNs@PEI@G、BMNs表面电位进行测试，分析结果如图2所示，从图中可以看到材料表面电位随层层自主装过程的变化，Fe3O4磁性纳米粒子表面电位为-20mV，其上依次包覆带正电的PEI和带负电的石墨烯后，磁性纳米粒子表面电位发生偏转，分别变为+37mV及-10.5mV，进一步说明PEI被成功包覆在磁性纳米粒子表面。当磁性纳米粒子MNs@PEI@G与J774A.1细胞共孵育后，磁性纳米粒子表面电荷变为-27mV，说明带负电的细胞膜被成功刮下，包覆在磁性纳米粒子表面，得到仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs。当将步骤21中洗涤后的J774A.1细胞采用细胞膜绿色荧光探针DiO一种亲脂性染料，其与细胞膜的磷脂双分子层结合后在488nm激光激发下发出绿色荧光预染，预染后的细胞与磁性纳米粒子MNs@PEI@G共孵育得到仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs，BMNs在488nm激光激发下发出绿色荧光，如图3A所示，说明细胞膜上的脂质分子被成功刮取至磁性纳米粒子MNs@PEI@G表面。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色方法比较J774A.1细胞总蛋白、J774A.1细胞膜蛋白及仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs所含蛋白，如图3B所示，从图中可以看出仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs所含蛋白与细胞膜蛋白相似，说明用此方法制备的细胞膜包覆的磁性纳米粒子与白细胞具有较大的相似性，因此仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs由于其同源性而被白细胞排斥，非特异性的白细胞吸附能够被显著抑制。当将步骤32中采用的链霉亲和素用异硫氰酸荧光素标记，修饰有DSPE-PEG2000-Biotin的磁性纳米粒子产物L31与染色后的链霉亲和素孵育后所得磁磁性纳米粒子产物L32在488nm激光激发下发出绿色荧光，如图3C所示，说明DSPE-PEG2000-Biotin分子及链霉亲和素已成功修饰到仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs上。当将具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs与异硫氰酸荧光素标记的驴抗山羊抗体在振荡条件下孵育2h，孵育所得磁性纳米粒子在488nm激光激发下发出绿色荧光，说明anti-EpCAM-Biotin已经被成功修饰在具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子上。3、磁性能检测采用ModelBHV-525型振动样品磁强计VSM分别检测了Fe3O4磁性纳米粒子MNs、具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线，结果如图4A所示，从图中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明MNs、BIMNs均无剩磁和矫顽力，具有超顺磁性，且饱和磁化强度较高，分别为57.21emug及50.27emug。为进一步测试BIMNs的磁响应时间，不同浓度的BIMNs水溶液在600nm处吸收强度进行检测，检测的BIMNs浓度-紫外吸收强度标准曲线如图4B所示。可以看出，BIMNs在600nm处的紫外吸收强度随其浓度的增加呈线性增加。用永磁体吸附100μgmL的BIMNs水溶液，测量不同吸附时间被永磁体吸附的APMNs在600nm处的吸光值，再根据BIMNs浓度-紫外吸收强度标准曲线算出不同吸附时间被永磁体吸附的BIMNs百分比，所得BIMNs吸附百分比随吸附时间变化曲线如图4C所示。从图4C可以看出，磁分离30s时，约有95％的BIMNs被分离。说明BIMNs的磁响应能力非常快，在后续捕获CTCs过程中，在BIMNs捕获CTCs后，能够快速地将其分离出来。实施例2本实施例具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步骤：1制备石墨烯和PAH包覆Fe3O4的磁性纳米粒子记为产物L1，MNs@PAH@G，包括以下分步骤：11将Fe3O4磁性纳米粒子MNs均匀分散到去离子水中，得到Fe3O4磁性纳米粒子浓度为1.25mgmL的悬浮液，将聚丙烯胺盐酸盐PAH溶解于去离子水中得到浓度为1mgmL的PEI水溶液；将5mL均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液和0.5mLPAH水溶液混合后，在振荡条件下反应1h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，即得到PAH包覆Fe3O4的磁性纳米粒子MNs@PAH，记为产物L11；12将产物L11均匀分散到去离子水中，得到产物L11浓度为0.33mgmL的悬浮液，将石墨烯均匀分散到去离子水中，得到石墨烯浓度为1.1mgmL的悬浮液；将15mL均匀分散有产物L11的悬浮液和0.5mL均匀分散有石墨烯的悬浮液混合后，在振荡条件下反应1h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次得到石墨烯包覆产物L11的磁性纳米粒子，即产物L1MNs@PAH@G；2制备具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs，包括以下分步骤：21将融合率达到90％的人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat，约2～3×106个利用细胞刮刀刮下，刮下的细胞用PBS缓冲液清洗2次后均匀分散到15mL高糖型无血清培养基DMEMGibco|LifeTechnologiesGrandIsland,USA中，得到均匀分散有细胞的培养基；22将5mg产物L1加入到均匀分散有细胞的培养基中混合均匀后于37℃、二氧化碳体积浓度为5％条件下孵育1.5h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤8次，得到白细胞膜包覆产物L1的磁性纳米粒子，即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs；3制备具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，包括以下步骤：31将C18-PEG2000-Biotin芃硕生物溶于PBS缓冲液中得到C18C18-PEG2000-Biotin浓度为10μgmL的PBS缓冲液；向5mg具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs中加入0.1mLC18-PEG2000-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下反应2h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L31；32将抗生物素蛋白AvidinSigma，CAS号：1405-69-2，产品编号215-783-6溶于PBS缓冲液中得到Avidin亲和素浓度为10μgmL的PBS缓冲液；向5mg产物L31中加入0.1mLAvidin亲和素的PBS缓冲液，在振荡条件下反应2h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L32；33将生物素修饰的anti-EpCAM-Biotin分散到PBS缓冲液中得到anti-EpCAM-Biotin浓度为0.25μgμL的PBS缓冲液；向5mg产物L32中加入10μLanti-EpCAM-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下于7℃反应6h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子；34将所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子分散于牛血清蛋白体积浓度为1％的PBS缓冲液中，在振荡条件下于7℃反应20min，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到后处理的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，并将其重悬于PBS缓冲液中，置于7℃冰箱内备用。实施例3本实施例具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子的制备包括以下步骤：1制备石墨烯和PEI包覆Fe3O4的磁性纳米粒子记为产物L1，MNs@PEI@G，包括以下分步骤：11将Fe3O4磁性纳米粒子MNs均匀分散到去离子水中，得到Fe3O4磁性纳米粒子浓度为1.25mgmL的悬浮液，将聚乙烯亚胺PEI溶解于去离子水中得到浓度为2mgmL的PEI水溶液；将2mL均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液和0.5mLPEI水溶液混合后，在振荡条件下反应3h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，即得到PEI包覆Fe3O4的磁性纳米粒子MNs@PEI，记为产物L11；12将产物L11均匀分散到去离子水中，得到产物L11浓度为0.25mgmL的悬浮液，将石墨烯均匀分散到去离子水中，得到石墨烯浓度为1mgmL的悬浮液；将20mL均匀分散有产物L11的悬浮液和0.5mL均匀分散有石墨烯的悬浮液混合后，在振荡条件下反应3h，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次得到石墨烯包覆产物L11的磁性纳米粒子，即产物L1MNs@PAH@G；2制备具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs，包括以下分步骤：21将融合率达到90％的小鼠单核巨噬细胞J774.1，约2～3×106个利用细胞刮刀刮下，刮下的细胞用PBS缓冲液清洗2次后均匀分散到10mL高糖型无血清培养基DMEMGibco|LifeTechnologiesGrandIsland,USA中，得到均匀分散有细胞的培养基；22将5mg产物L1加入到均匀分散有细胞的培养基中混合均匀后于37℃、二氧化碳体积浓度为5％条件下孵育2h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤20次，得到白细胞膜包覆产物L1的磁性纳米粒子，即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs；3制备具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，包括以下步骤：31将cholesterol-PEG2000-Biotin芃硕生物溶于PBS缓冲液中得到cholesterol-PEG2000-Biotin浓度为30μgmL的PBS缓冲液；向5mg具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BMNs中加入0.1mLcholesterol-PEG2000-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下反应5h，之后对所得反应进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L31；32将链霉亲和素阿拉丁，CAS号：9013-20-1，产品编号S103034溶于PBS缓冲液中得到链霉亲和素浓度为30μgmL的PBS缓冲液；向5mg产物L31中加入0.1mL链霉亲和素的PBS缓冲液，在振荡条件下反应5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到产物L32；33将生物素修饰的anti-EpCAM-Biotin分散到PBS缓冲液中得到anti-EpCAM-Biotin浓度为0.75μgμL的PBS缓冲液；向5mg产物L32中加入10μLanti-EpCAM-Biotin的PBS缓冲液，在振荡条件下于4℃反应12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子；34将所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子分散于牛血清蛋白体积浓度为1.0％的PBS缓冲液中，在振荡条件下于4℃反应30min，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤3次，得到后处理的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs，并将其重悬于PBS缓冲液中，置于4℃冰箱内备用。应用例以下应用例中以MCF-7或GFP-MCF-7细胞为例，对用实施例1制备的具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs富集CTCs进行详细的说明。以下应用例中采用的人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、小鼠单核巨噬细胞J774A.1购自上海拜力生物。应用例1本应用例的目的在于考察具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs浓度、孵育时间对BIMNs富集CTCs细胞的富集效率的影响。本实施例以上皮细胞粘附分子高表达的人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG2为循环肿瘤细胞的模型细胞，而表达或无表达上皮细胞粘附分子的T淋巴细胞白血病细胞Jurkat和小鼠单核巨噬细胞J774A.1为对照组细胞。在六份1mL含有MCF-7细胞的PBS缓冲液MCF-7细胞数量为2×105个中分别加入不同质量实施例1制备的的BIMNsBIMNs的终浓度如图5A所示，在室温下孵育15min，孵育结束后对孵育产物进行磁分离，同时收集上清液，用细胞计数仪对上清液中的细胞进行计数，每个样品测三次，取其平均值记为上清液中的细胞数，进而得到上清液细胞浓度。根据未富集细胞总数＝上清液细胞浓度×上清液体积，可得到未被富集的MCF-7细胞数目，再根据富集效率＝1-未富集细胞总数投入细胞总数×100％，可得到BIMNs对MCF-7细胞的富集效率，测试结果如图5A所示，随着BIMNs浓度的增加75μgm至125μgmL，BIMNs对MCF-7细胞的捕获效率从95.4％增长至98.5％。但进一步加大BIMNs的浓度至250μgmL，捕获效率仍然维持在98.5％左右，说明对于2×105个MCF-7细胞，BIMNs的最佳用量约为125μg。在六份1mL含有MCF-7细胞的PBS缓冲液MCF-7细胞数量为2×105个中分别加入125μg实施例1制备的BIMNs，在室温下孵育不同时间孵育时间如图5B所示，孵育结束后对孵育产物进行磁分离，同时收集上清液，用细胞计数仪对上清液中的细胞进行计数，每个样品测三次，取其平均值记为上清液中的细胞数，进而得到上清液细胞浓度。根据未富集细胞总数＝上清液细胞浓度×上清液体积，可得到未被富集的MCF-7细胞数目，再根据富集效率＝1-未富集细胞总数投入细胞总数×100％，可得到BIMNs对MCF-7细胞的富集效率，测试结果如图5B所示，BIMNs对MCF-7细胞的捕获效率在90s时可达到96.8％；再延长孵育时间，BIMNs对MCF-7细胞的捕获效率保持在96.5％左右，说明对于2×105个MCF-7细胞，BIMNs的最佳孵育时间约为90s。在1mLMCF-7细胞的PBS缓冲液MCF-7细胞数量为4×105个、1mLHepG2细胞的PBS缓冲液HepG2细胞数量为4×105个、1mLJurkat细胞的PBS缓冲液Jurkat细胞数量为4×105个、1mLJ774A.1细胞的PBS缓冲液J774A.1细胞数量为4×105个中分别加入250μg实施例1制备的BIMNs，在室温下孵育90s；同时在1mLMCF-7细胞的PBS缓冲液MCF-7细胞数量为4×105个、1mLHepG2细胞的PBS缓冲液HepG2细胞数量为2×105个、1mLJurkat细胞的PBS缓冲液Jurkat细胞数量为4×105个、1mLJ774A.1细胞的PBS缓冲液J774A.1细胞数量为4×105个中分别加入250μg实施例1制备的无抗体BIMNs步骤32所得产物，在室温下孵育90s；孵育结束后对孵育产物进行磁分离，同时收集上清液，用细胞计数仪对上清液中的细胞进行计数，每个样品测三次，取其平均值记为上清液中的细胞数，进而得到上清液细胞浓度。根据未富集细胞总数＝上清液细胞浓度×上清液体积，可得到各细胞未被富集的细胞数目，再根据富集效率＝1-未富集细胞总数投入细胞总数×100％，可得到BIMNs对各细胞的富集效率，并以没有测试结果如图5C所示。由图可知，没有修饰anti-EpCAM-Biotin抗体的磁性纳米粒子对四种细胞的捕获效率都很低约5％，而修饰上anti-EpCAM-Biotin抗体的BIMNs对MCF-7细胞和HepG2细胞的捕获效率增加至95％，而对Jurkat及J774A.1细胞的非特异性捕获效率仍然维持在5％左右。说明具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs对上皮细胞粘附分子高表达的细胞具有较高的捕获效率，而对上皮细胞粘附分子无低表达的细胞的非特异性吸附较低，具有较强的抗非特异性包细胞吸附能力，为其后续在复杂样本如全血中的运用奠定基础。应用例2为了探究BIMNs在不同环境中对目标细胞的检测限，本应用例在1mLPBS缓冲液pH＝7.4、106个JurkatT细胞和健康人血中分别放置了1～150个带有绿色荧光蛋白的人乳腺癌细胞GFP-MCF-7得到三组人造样本。再向三组人造样本中分别加入125μg实施例1制备的BIMNs后在室温振荡条件下200～300转分孵育90s后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物，再将磁分离所得产物重新分散于0.5～1.2mLPBS缓冲液pH＝7.4后，分别加入96孔板中，之后在荧光显微镜下逐一统计发绿色荧光的细胞记为捕获得到的绿色荧光蛋白的GFP-MCF-7，统计结果如图6所示。从图中可以看出，BIMNs在PBS缓冲液、106个JurkatT细胞及复杂的全血中的检出限分别为1个、3个、3个，由此可见，BIMNs在PBS缓冲液、106个JurkatT细胞及复杂的全血中的检出限极低。BIMNs在PBS缓冲液、106个JurkatT细胞及复杂的全血中的平均富集效率分别能达到98.7％，92.7％及86.7％拟合曲线的斜率。表明本发明制备得到的具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs能够在检测限低、复杂的血液样本中高效地捕获CTCs，具有从全血样本中分离CTCs的巨大潜力。应用例3本应用例目的在于考察本发明制备的具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs在混合细胞模拟样本中的抗非特异性吸附能力。本应用例包括以下步骤：1将2×105MCF-7细胞【由celltrackerDeepRed厂家Invitrogen，牌号C7025预染，其633nm激光激发下呈红色】与2×105Jurkat细胞【celltrackerCMFDA厂家Invitrogen，牌号C34565预染，488nm激光激发下呈绿色混合，配置两组混合细胞样本，皆分散在1mLPBS缓冲液中。2向第一份混合细胞中其中加入100uL美天旎商用磁珠，在4℃下孵育30分钟，之后用相应磁分离柱分离所得孵育液，收集富集后含有目标MCF-7细胞的组分并分散于PBS缓冲液pH＝7.4中，置于玻底皿上，在488nm和633nm激光激发下得到相应的共聚焦叠加图，如图7A所示。3向第二份混合细胞中其中加入125μg实施例1制备的BIMNs，孵育90s后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物，再将磁分离所得产物重新分散于PBS缓冲液pH＝7.4中，置于玻底皿上，在488nm和633nm激光激发下得到相应的共聚焦叠加图，如图7B所示。统计捕获前、采用BIMNs捕获后、采用美天旎商用磁珠捕获后的混合细胞体系中MCF-7细胞数量，得到捕获前后的MCF-7细胞纯度，如图7C所示。可以看出采用BIMNs捕获所得MCF-7细胞纯度高达99.4％，整个视野中无Jurkat细胞。而采用美天旎商用磁珠捕获所得MCF-7细胞纯度较低只能达到77.5％，其所富集产物中还有较多的Jurkat细胞。由此可见，本发明提供的具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs可以有效抑制对混合细胞模拟样本中白细胞的吸附，大大增加了富集样本中MCF-7细胞的纯度，为后续CTCs下游研究打下良好的基础。应用例4本应用例采用三色细胞免疫法鉴定从向上皮表型癌患者及健康正常志愿者全血中富集CTCs细胞的数目。向癌症患者患者信息见表1所示全血1.5mL中加37.5μg实施例1制备的具有仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs，孵育5分钟，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物。向健康志愿者健康志愿者信息见表2所示全血1mL中加25μg实施例1制备的具有仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs，在室温振荡条件下200～300转分孵育5分钟，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物。将收集到的细胞用4％质量体积比，质量以mg计，体积以mL计多聚甲醛厂家索莱宝有限公司，牌号P1110的PBS缓冲液固定10分钟，固定结束后用PBS缓冲液清洗三次；再用体积浓度为0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚厂家索莱宝有限公司，CAS：9002-93-1，cat：T8200的PBS缓冲液孵育10分钟，孵育结束后用PBS缓冲液清洗三次；接着用1％质量体积比，质量以mg计，体积以mL计牛血清蛋白武汉谷歌生物有限公司，cat：G5001，Lot：160862的PBS缓冲液孵育30分钟，孵育结束后用PBS缓冲液清洗三次；之后加入30μgmL-1AlexaFluor647-CK18，30μgmL-1AlexaFluor488-CD45，20mMHochest33324，于4℃染色12小时，染色结束后用PBS缓冲液清洗三次即得到三色细胞免疫染色后的固体产物。在染色过程结束后，将染色细胞重新分散于PBS缓冲液中，置于玻底皿上，在405nm，488nm，633nm激光激发下，得到对应的共聚焦图及共聚焦叠加图如图8所示。以上实验重复三次，统计全血样本中每次检测到的CTCs数目，见表1及表2所示。从图8可以看出，带有蓝色荧光信号，及红色荧光信号的细胞被认为是CTCs，而带有蓝色荧光信号，及绿色荧光信号的细胞被认为是白细胞，说明采用三色染色法可以实现对CTCs细胞与白细胞的区分，后续实验可使用该方法区分循环肿瘤细胞与白细胞。表1.癌症患者基本信息表及癌症患者全血中CTCs的数目统计表a平均RSD:8.7±5.6％表2.健康志愿者基本信息及循环肿瘤细胞数目统计表癌症患者血样及健康志愿者血样中发现的CTCs细胞数目统计见表1及表2所示，8例癌症患者每1.5毫升血液中有2至48个循环肿瘤细胞被检测到，而5例健康样本中没有发现循环肿瘤细胞，这说明本发明制备的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BIMNs可以成功应用于真实的临床血液样本中。此外，同一样本中循环肿瘤细胞的三次计数结果相差不大，显示良好的再现性平均相对标准偏差8.7±5.6％，表明本发明制备的具有仿细胞结构的磁性纳米粒子BIMNs有良好的重现性和可靠性，有很大临床运用的前景。应用例5本应用例目的在于考察本发明制备的具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs在全血模拟样本中的抗非特异性吸附能力。本应用例包括以下步骤：1先向100uL全血去红全血中加入1×104MCF-7细胞，得到两份全血模拟样本，分别向两份全血模拟样本中加入125μg实施例1制备的BIMNs，在室温振荡条件下100～300转分孵育90s后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物。2先向100uL全血去红全血中加入1×104MCF-7细胞后，得到两份全血模拟样本，分别向两份全血模拟样本中加入100uL美天旎磁珠，在4℃下孵育30分钟，之后用相应磁分离柱分离所得孵育液，并收集分离出的固体产物。3将步骤1和步骤2中从去红全血模拟样本中磁分离所得固体产物进行三色细胞免疫染色后，所得染色后的固体产物分散在PBS缓冲液pH＝7.4中，置于玻底皿上，在405nm，488nm和633nm激光激发下，得到相应的共聚焦叠加图，如图9A-B所示。4将步骤1和步骤2中从全血模拟样本中磁分离所得固体产物进行三色细胞免疫染色后，所得染色后的固体产物分散在PBS缓冲液pH＝7.4中，置于玻底皿上，在405nm，488nm和633nm激光激发下，得到相应的共聚焦叠加图，如图9D-E。上述三色细胞免疫染色操作如下：标准的三色ICC法通常包括对能选择性结合上皮细胞AlexaFluor647标记的抗细胞角蛋白18单克隆抗体，AlexaFluor647-CK18，633nm激光激发，呈红色、白细胞AlexaFluor488标记的抗白细胞共同抗原，AlexaFluor488-CD45厂家abcam，牌号ab197730，405nm激光激发，呈绿色的探针，以及细胞核染料Hochest33324厂家abcam，牌号ab206269，405nm激光激发，呈蓝色。三色细胞免疫染色步骤如下：将步骤1从全血样本中收集到的细胞用4％质量体积比，质量以mg计，体积以mL计多聚甲醛厂家索莱宝有限公司，牌号P1110的PBS缓冲液固定10分钟，固定结束后用PBS缓冲液清洗三次；再用体积浓度0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚厂家索莱宝有限公司，CAS：9002-93-1，cat：T8200的PBS缓冲液孵育10分钟，孵育结束后用PBS缓冲液清洗三次；接着用1％质量体积比，质量以mg计，体积以mL计牛血清蛋白武汉谷歌生物有限公司，cat：G5001，Lot：160862的PBS缓冲液孵育30分钟，孵育结束后用PBS缓冲液清洗三次；之后加入30μgmL-1AlexaFluor647-CK18，30μgmL-1AlexaFluor488-CD45，20mMHochest33324，于4℃染色12小时，染色结束后用PBS缓冲液清洗三次即得到三色细胞免疫染色后的固体产物。通过三色细胞免疫染色法，统计计算步骤1、2采用商用磁珠、BIMNs从去红全血模拟样本和全血模拟样本中捕获MCF-7细胞的捕获效率和捕获纯度，如图8C、图8F所示。捕获效率由捕获到的MCF-7细胞数目与放入到全血样本中的MCF-7细胞数目相比得到。捕获纯度由捕获到的MCF-细胞数目与捕获到的全部细胞数目相比得到。图9A为向100uL去红全血中加入1×104MCF-7细胞后,用商用磁珠捕获细胞，经三色细胞免疫染色后，所得激光共聚焦叠加图。图9B为向100uL去红全血中加入1×104MCF-7细胞后,用BIMNs捕获细胞，经三色细胞免疫染色后，所得激光共聚焦叠加图。图9C为商用磁珠、BIMNs在含有MCF-7细胞的去红血样本中的捕获效率及捕获MCF-7细胞纯度统计图。图9D为向100uL全血中加入1×104MCF-7细胞后,用商用磁珠捕获细胞，经三色细胞免疫染色后，所的激光共聚焦叠加图。图9E为向100uL全血中加入1×104MCF-7细胞后,用BIMNs捕获细胞，经三色细胞免疫染色后，所的激光共聚焦叠加图。图9F为商用磁珠、BIMNs在含有MCF-7细胞的全血样本中的捕获效率及捕获MCF-7细胞纯度统计图。从图9可以看出，BIMNs在全血样本和去红血样本中，捕获效率分别是81.2％、84.2％，捕获纯度分别是96.7％、96.9％，说明具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子在极为复杂的血液中依然能实现高效率，高纯度的CTCs捕获。然而，商用磁珠在全血样本和去红血样本中，捕获效率分别为10.7％、69.5％，捕获纯度为44.3％、72.5％。显然，全血中大量的红细胞大大削弱了商业磁珠的捕获效率和捕获纯度。以上结果证实了具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs的优越性能，特别是全血抗白细胞的能力。因此，较商用磁珠而言，在全血中直接使用BIMNs可以提供更准确的结果。应用例6本应用例目的在于考察采用本发明制备的具有细胞结构的免疫磁性纳米粒子BIMNs富集的CTCs细胞活性。本应用例包括以下步骤：A向1×106MCF-7细胞中加入625μg实施例1制备的具有仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs，在室温振荡条件下200～300转分孵育90s后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物。取15磁分离固体产物分散在1mLPBS缓冲液pH＝7.4中后，加入AOPI细胞死活染液厂家索莱宝有限公司，AO货号：CA1143，PI货号：P8080，孵育5分钟后，采用PBS缓冲液洗涤一次，以1200转分钟离心收集固体产物，收集的固体产物重新分散在1mLPBS缓冲液中，置于玻底皿上，在488nm，543nm激光激发下，得到相应的共聚焦叠加图，如图10A。B将2×105MCF-7细胞分散在1mLPBS缓冲液中后，加入AOPI细胞死活染液，孵育5分钟后，采用PBS缓冲液洗涤一次，以1200转分钟离心收集固体产物，收集的固体产物重新分散在1mLPBS缓冲液中，置于玻底皿上，在488nm，543nm激光激发下，得到相应的共聚焦叠加图，如图10B所示。C向1×106MCF-7细胞中加入625μg实施例1制备的具有仿细胞结构的BIMNs，孵育90s后，将孵育所得产物进行磁分离，并收集磁分离所得产物。将磁分离固体产物分散在2mL完全培养基DMEM，高糖中，并置于6孔板内，于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养，待细胞融合率达85％及以上时，进行传代。整个培养和传代过程保持无菌。在细胞传代不同阶段得到的明场细胞状态图，如图11所示。吖啶橙AO为一种具有膜通透性的荧光染料，该染料能与DNARNA结合，在488nm激光激发下，发出黄绿色荧光。而碘化丙啶PI也能与DNA结合，在543nm激光激发下，发出红色荧光。但是该染料无膜通透性，故仅死亡细胞的DNA能与之结合。由图10A-B可知，经过整个富集和分离过程，MCF-7细胞的活性与对照组相当～98％，说明孵育及分离过程对MCF-7细胞活性影响较小，这说明具有仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs能用于高活性CTCs的获取。由富集细胞体外培养图11可知，经过孵育及分离过程后，MCF-7细胞的贴壁能力及增殖能力没有受到影响，且无明显形貌变化。说明孵育及分离过程对MCF-7细胞增殖功能及形貌影响较小，这说明具有仿细胞结构的免疫磁纳米粒子BIMNs富集的循环肿瘤细胞能直接进行体外培养。

权利要求：1.具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，其特征在于是由Fe3O4磁性纳米粒子、依次包覆于Fe3O4磁性纳米粒子表面的高分子聚合物层、石墨烯层和白细胞膜层构成。2.根据权利要求1所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子，其特征在于所述高分子聚合物为聚丙烯胺盐酸盐或聚乙烯亚胺；所述石墨烯为羧基化石墨烯。3.权利要求1所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子制备方法，其特征在于步骤如下：1通过静电作用，在Fe3O4磁性纳米粒子表面依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层得到产物L1；2将产物L1与均匀分散有细胞的培养基混合均匀后于37℃、二氧化碳体积浓度为5％条件下孵育1.5～2h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到白细胞膜包覆产物L1的磁性纳米粒子，即具有仿细胞结构的磁性纳米粒子。4.根据权利要求3所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述步骤1的分步骤如下：11将均匀分散有Fe3O4磁性纳米粒子的悬浮液和高分子聚合物的水溶液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应1～3h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到包覆有高分子聚合物层的Fe3O4磁性纳米粒子，记为产物L11；所述反应体系中Fe3O4磁性纳米粒子与高分子聚合物的质量比为1:0.08-0.4；12将均匀分散有产物L11的悬浮液和均匀分散有石墨烯的悬浮液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应1～3h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到在Fe3O4磁性纳米粒子表面依次包覆高分子聚合物层和石墨烯层得到产物L1；所述反应体系中产物L11与石墨烯的质量比为1:0.1-0.11。5.根据权利要求3或4所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述高分子聚合物为聚丙烯胺盐酸盐或聚乙烯亚胺；所述石墨烯为羧基化石墨烯；所述均匀分散有细胞的培养基中的细胞来自小鼠单核巨噬细胞或人T淋巴细胞白血病细胞。6.一种具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，其特征在于通过在权利要求1或2所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子的白细胞膜上依次修饰上脂质分子-聚乙二醇-生物素分子、亲和素以及抗体得到。7.根据权利要求6所述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子，其特征在于所述脂质分子-聚乙二醇-生物素分子为C18-PEG2000-Biotin、cholesterol-PEG2000-Biotin或DSPE-PEG2000-Biotin；所述亲和素为链霉亲和素或抗生物素蛋白；所述抗体为生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体。8.要求6所述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于步骤如下：31将权利要求1或2所述具有仿细胞结构的磁性纳米粒子与含脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应2～5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到产物L31；所述反应体系中具有仿细胞结构的磁性纳米粒子与脂质分子-聚乙二醇-生物素分子的质量比为5000：1～3；32将产物L31与含亲和素的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下反应2～5h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到产物L32；所述反应体系中产物L31与亲和素的质量比为5000：1～3；33将产物L32与含抗体的PBS缓冲液混合后形成反应体系，在振荡条件下于4～7℃反应6～12h，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤得到具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子；所述反应体系中产物L32与抗体的质量比为1000：0.5～1.5。9.根据权利要求8所述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子制备方法，其特征在于所述脂质分子-聚乙二醇-生物素分子为C18-PEG2000-Biotin、cholesterol-PEG2000-Biotin或DSPE-PEG2000-Biotin；所述亲和素为链霉亲和素或抗生物素蛋白；所述抗体为生物素修饰的抗上皮细胞粘附分子抗体；对步骤33所得具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子可进行以下后处理：将具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子分散于牛血清蛋白质量浓度为0.5％～1.0％的PBS缓冲液中，在振荡条件下于4～7℃反应20～30min，之后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物进行洗涤即可。10.权利要求6或7所述具有仿细胞结构的免疫磁性纳米粒子在富集循环肿瘤细胞中的应用。

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