申请/专利权人：广东省生物资源应用研究所

申请日：2020-04-21

公开（公告）日：2020-05-29

公开（公告）号：CN111206015A

主分类号：C12N5/076(20100101)

分类号：C12N5/076(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.31#授权;2020.06.23#实质审查的生效;2020.05.29#公开

摘要：本发明提供了一种利用FACTⅢ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。该方法利用转壁氏生物反应器（RCCS）构建三维动态培养环境，选择FACTⅢ微载体为支架材料，建立了能支持小鼠睾丸SSCs体外快速增殖和维持其未分化特性的三维动态培养体系。该三维动态培养体系下，SSCs在RCCS中培养一周后，表现出极优的增殖效果，尤其在体外培养17‑22d获得SSCs得到快速增殖，增殖的SSCs细胞仍保留着其未分化状态的生物学特性和功能。本发明方法具有操作简单，培养成本低，重复性好，培养成功率高，无需传代，可避免饲养层细胞污染等明显优势，提供了一种可靠的SSC体外培养技术方案。

主权项：1.一种利用FACTⅢ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将DMEM完全培养基加至转壁氏细胞培养系统中，加入经预处理的FACTⅢ微载体；将原代精原干细胞接种至FACTⅢ微载体上培养，获得精原干细胞；所述的FACTⅢ微载体预处理的具体步骤为：将FACTⅢ微载体用无菌PBS溶液进行洗涤，并浸泡过夜，于120℃高压灭菌30min；将灭菌后的FACTⅢ微载体转移至15mL无菌离心管中先后用其5倍体积的10-20ngmL多聚赖氨酸溶液和5-20μgmL层黏蛋白溶液进行包被处理，将包被处理后的FACTⅢ微载体在DMEM完全培养基中浸泡过夜，即得；所述的原代精原干细胞是通过以下方法获得：取出生后5~7天的雄性昆明小鼠睾丸，去掉睾丸白膜，先以1mgmLⅣ型胶原酶和20µgmL的DNAseⅠ联合消化，然后以0.25%胰酶-0.01%EDTA和20µgmL的DNAaseⅠ联合消化，用含10wt%FBS的DMEM不完全培养基终止消化，用60µm细胞筛过滤，于低温离心机1000rpm离心6min，重悬细胞，获得含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液；所述的DMEM完全培养基组成为：DMEM不完全培养基中添加1%vv的必需氨基酸溶液、1%vv的非必需氨基酸溶液、1%vv维生素溶液、55µMβ-巯基乙醇溶液、2mML-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、5wt%FCS、1%vv的双抗溶液、20ngmLrmbFGF因子、20ngmLrrGDNF因子和103UmLmLIF因子。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 广东省生物资源应用研究所 一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法

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