申请/专利权人：山东鲁抗医药股份有限公司

申请日：2018-11-08

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN109402104B

主分类号：C12N11/091(20200101)

分类号：C12N11/091(20200101);C12N9/80(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.17#授权;2019.03.26#实质审查的生效;2019.03.01#公开

摘要：本发明提供了一种头孢菌素酰化酶的固定化方法，属于酶的固定化技术领域，所述方法包括以下步骤：1将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2将步骤1获得的带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶；所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；所述载体为氨基树脂。本发明所述方法制备获得的头孢菌素酰化酶酶活性高，稳定性好。

主权项：1.一种头孢菌素酰化酶的固定化方法，包括以下步骤：1将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2将步骤1获得的带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙胺进行第二缩合反应8～20h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶；所述桥接体为氯乙酰氯或溴丁酰溴；所述载体为氨基树脂；步骤1中所述滴加的时间为20～60min，所述滴加和第一缩合反应的温度独立为-10～0℃；所述桥接体与载体的质量比为0.05～0.2：1；步骤2中所述带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液的质量比为1：1～5，所述头孢菌素酰化酶水溶液的酶活力为80～100UmL；步骤2中所述带桥接体的载体与三乙胺的质量比为1：0.1～0.5；所述载体溶液包括氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水；所述氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水的质量比为1：0.1～0.5：5～20：2～5，所述缚酸剂为三乙胺、碳酸氢钠或碳酸钠；所述桥接体溶液中包括桥接体与溶剂，所述桥接体与溶剂的质量比为0.05～0.2：0.1～1，所述溶剂为与水互溶的非质子极性溶剂。

全文数据：一种头孢菌素酰化酶的固定化方法及固定化酶技术领域本发明属于酶的固定化技术领域，尤其涉及一种头孢菌素酰化酶的固定化方法及固定化酶。背景技术固定化酶是20世纪60年代发展起来的一种新技术，所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。现有的固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。吸附法是最早出现的固定化方法，吸附法又可以分为两种，分别是离子交换吸附和物理吸附。吸附法条件比较温和，不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶的催化性能不会产生大的影响；但是酶和载体之间的结合力较弱，在一些特殊的条件下，比如高盐浓度、高温等条件下，酶就很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物。包埋法是将酶包埋于聚合物的孔隙中的固定化方法。根据包埋形态类型可将包埋法分为网格型和微囊型两种。利用聚丙烯酰胺、聚乙妇醇、淀粉、明胶、海藻酸等载体的细微网格将酶包埋进去的方法称为网格型包埋。微囊型是指将酶包埋于高分子半透膜中形成微胶囊。包埋法容易出现酶的漏失和扩散限制等问题。交联法指的是利用一些多功能交联试剂，如戊二醛等，在酶分子间或酶分子和载体分子间形成共价键，在不同的交联条件下，生产固定化酶。但是采用交联剂戊二醛等形成的共价亚胺键很容易遇水断裂，酶容易从载体上脱落、流失。共价结合法是通过载体表面的活性功能基团和酶分子上的非必需基团形成化学共价键，从而实现不可逆结合的酶固定方法。现有技术采用环氧树脂、1,3二卤代烷烃，1,4二卤代烷烃，1,5二卤代烷烃，实现载体与酶的共价结合；存在的缺点是：1、采用环氧树脂由于环氧基的亲电活性不高，反应条件比较激烈，容易造成酶的失活；2、采用双取代卤代烷烃作为桥接体连接酶和载体时，由于作为桥接体的卤代烷烃两端的碳的亲电活性相同，很容易造成卤代烷烃两端的碳都和载体或酶结合，无法实现载体和酶之间的连接。发明内容有鉴于此，本发明提供一种头孢菌素酰化酶的固定化方法及固定化酶，所述固定化方法能够有效实现载体和酶之间的连接，且连接条件温和，不易造成酶的失活，获得的固定化酶稳定性好。为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：一种头孢菌素酰化酶的固定化方法，包括以下步骤：1将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2将步骤1获得的带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶；所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；所述载体为氨基树脂。优选的，所述桥接体为卤乙酰卤、卤丙酰卤、卤丁酰卤或卤戊酰卤。优选的，步骤1中所述滴加的时间为20～60min，所述滴加和第一缩合反应的温度独立为-10～40℃。优选的，所述桥接体与载体的质量比为0.05～0.2：1。优选的，步骤2中所述带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液的质量比为1：1～5，所述头孢菌素酰化酶水溶液的酶活力为80～100UmL。优选的，步骤2中所述带桥接体的载体与三乙胺的质量比为1：0.1～0.5。优选的，步骤1中所述第一固液分离的方法为抽滤，所述抽滤后的滤饼依次用有机溶剂和水洗涤获得带桥接体的载体。优选的，所述载体溶液包括氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水；所述氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水的质量比1：0.1～0.5：5～20：2～5。优选的，所述缚酸剂为三乙胺、碳酸氢钠或碳酸钠。优选的，所述桥接体溶液中包括桥接体与溶剂，所述桥接体与溶剂的质量比为0.05～0.2：0.1～1，所述溶剂为与水互溶的非质子极性溶剂。本发明还提供了所述头孢菌素酰化酶的固定化方法制备获得的固定化的头孢菌素酰化酶。本发明的有益效果：本发明提供的头孢菌素酰化酶的固定化方法，选择主链包含2～8个碳原子的卤酰卤作为桥接体，所述桥接体两端的碳的亲电活性差别大，按照本发明中限定的加料顺序和反应条件进行头孢菌素酰化酶的固定化，可以避免桥接剂两端同时和载体或同时和酶连接，能够实现载体和酶之间的有效连接，同时连接条件温和，不容易造成酶的失活；本发明所述方法采用共价键结合，固定化酶稳定性好。根据实施例的记载，本发明提供的固定化头孢菌素酰化酶活性较高125Ug，裂解20批头孢菌素C钠盐后酶活力任然保持在120Ug左右，没有出现明显下降，稳定性好。附图说明图1为本发明提供了一种头孢菌素酰化酶的固定化方法的流程图。具体实施方式本发明提供了一种头孢菌素酰化酶的固定化方法，包括以下步骤：1将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2将步骤1获得的带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶；所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；所述载体为氨基树脂。本发明中所述载体溶液包括氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水；所述氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水的质量比1：0.1～0.5：5～20：2～5，优选为1：0.2～0.4：8～15：3～4。本发明对所述氨基树脂的来源没有特殊限定，采用市售氨基树脂即可，在本发明具体实施过程中，所述氨基树脂购自西安蓝晓科技有限公司，商品名为LX1000HA。本发明中所述缚酸剂优选为三乙胺、碳酸氢钠或碳酸钠，本发明中，所述与水互溶的非质子极性溶剂优选为丙酮、乙腈或四氢呋喃。本发明对所述缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。本发明中，所述载体溶液通过以下方法制备获得：将所述氨基树脂、与水互溶的非质子极性溶剂和水在搅拌的条件下混合，然后加入缚酸剂搅拌获得所述载体溶液。本发明中，所述搅拌的转速优选为40～100rpm，更优选为50～90rpm，本发明对所述搅拌的时间没有特殊限定，以混合均匀为宜。本发明在所述搅拌过程中进行降温，将所述载体溶液的温度降至-10～40℃。本发明中，所述降温优选的采用冰盐水进行。本发明中，所述桥接体溶液中包括桥接体与溶剂，所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤，优选的为卤乙酰卤、卤丙酰卤、卤丁酰卤或卤戊酰卤；所述溶剂为与水互溶的非质子极性溶剂，所述与水互溶的非质子极性溶剂为丙酮、乙腈或四氢呋喃。本发明中，所述桥接体与溶剂的质量比为0.05～0.2：0.1～1，优选为0.1～0.18：0.2～0.8。本发明中所述桥接体溶液通过将所述桥接体与溶剂混合获得。本发明将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体。在本发明中，所述桥接体与载体的质量比优选为0.05～0.2：1，更优选为0.1～0.15：1；本发明中，所述滴加的时间优选为20～60min，更优选为30～50min；所述滴加的温度优选为-10～40℃，更优选为-9～0℃。本发明中，所述第一缩合反应的时间优选为3～4h，所述第一缩合反应的温度优选为-10～40℃，更优选为-9～0℃。本发明中所述第一缩合反应过程中，酰卤对氨基的亲电进攻，形成酰胺键。本发明在所述第一缩合反应结束后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体。本发明中，所述第一固液分离的方法优选为抽滤，所述抽滤后的滤饼依次用有机溶剂和水洗涤获得带桥接体的载体。本发明中，所述有机溶剂优选为丙酮，所述有机溶剂洗涤的次数优选为1～3次，更优选为2次，所述水洗涤的次数优选为1～3次，更优选为2次。本发明对洗涤所用有机溶剂和水的质量没有特殊限定，能够实现洗涤即可，在本发明具体实施过程中，所述有机溶剂和水的质量独立的为所述滤饼质量的2～5倍。本发明所述洗涤后的滤饼即为带桥接体的载体。本发明在获得所述带桥接体的载体后，将所述带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液。本发明中，所述头孢菌素酰化酶水溶液的酶活力优选为80～100UmL，更优选为85～95UmL。本发明中所述头孢菌素酰化酶水溶液是由头孢菌素酰化酶与水混合浓缩制备而成。本发明对所述头孢菌素酰化酶的来源没有特殊要求，采用用于头孢菌素C裂解用的头孢菌素酰化酶即可。本发明中所述带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液的质量比优选为1：1～5，更优选为1：2～4。本发明中所述混合搅拌的转速优选为40～100rpm，更优选为50～90rpm，本发明对所述混合搅拌的时间没有特殊限定，以实现混合均匀为宜；所述混合搅拌的温度优选为-10～40℃，更优选为0～10℃。本发明在获得所述混合料液后，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h。本发明中所述三乙胺与所述混合料液的质量比优选为0.1～0.5：2～6，更优选为0.2～0.4：3～5；所述三乙胺的滴加时间优选为20～60min，更优选为30～50min。本发明中所述三乙胺，优选为三乙胺水溶液，所述三乙胺水溶液由三乙胺与水混合制备而成，所述三乙胺水溶液中三乙胺的体积百分含量优选为18～25％，更优选为21～21.5％。本发明中，所述第二缩合反应的温度优选为-10～40℃，更优选为0～10℃；所述第二缩合反应的时间优选为25～35h。本发明在所述第二缩合反应结束后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶。本发明中，所述第二固液分离的方法优选为抽滤，所述抽滤后的滤饼水洗涤获得固定化的头孢菌素酰化酶。本发明中，所述水洗涤的次数优选为1～3次，更优选为2次所述洗涤用水的质量优选为滤饼质量的2～10倍。本发明提供了上述制备方法制备获得的固定化头孢菌素酰化酶，所述头孢菌素酰化酶的湿品酶活力为125～130Ug，所述固定化头孢菌素酰化裂解20批头孢菌素C钠后酶活力没有出现明显下降，稳定性好。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1步骤1桥接体和载体的连接：a.丙酮600mL、纯化水60mL、60rpm搅拌下加入氨基树脂30g、加入三乙胺3mL，搅拌降温-10～-5℃。b.2.2g氯乙酰氯溶于10mL丙酮中。c.控制温度-10～-5℃，将氯乙酰氯的丙酮溶液滴加入氨基树脂溶液中。滴加时间20～60min，控温-10～-5℃，进行第一缩合反应2～5h。d.抽滤，滤饼采用100mL丙酮分两次洗涤，100mL纯化水分两次洗涤，已带桥接体的载体。步骤2已带桥接体的载体和头孢菌素酰化酶的连接。a.50mL酶活100UmL头孢菌素酰化酶水溶液，搅拌加入已带桥接体的载体31g，搅拌速度30-50rpm，降温0～10℃。b.2.7mL三乙胺溶于10mL水中。c.控制反应温度0～10℃，将三乙胺水溶液滴加入头孢菌素酰化酶水溶液中，滴加时间20～60min，控温0～10℃，进行第二缩合反应8～10h。d.抽滤，200mL纯化水分三次洗涤。得固定化头孢菌素酰化酶。固定化酶裂解实验：1000mL头孢菌素C裂解实验装置，加入30克固定化头孢菌素酰化酶，10克头孢菌素C钠盐溶于400mL水中，氨水调节PH8.5，控制温度20-25℃，采用自控加氨装置控制PH8.5-9.0，液相跟踪反应10g头孢菌素C钠剩余0.00025％时，终止反应，通过实验装置下的滤网，固定化酶留在实验装置中，继续下一批生产；滤液收集结晶制备7-氨基头孢烷酸7-ACA。所述固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果见表1。表1实施例1制备得到的固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果由表1的数据可知，本实施例提供的固定化头孢菌素酰化酶活性较高，裂解20批头孢菌素C钠后酶活力没有出现明显下降，稳定性好。实施例2步骤1桥接体和载体的连接：a.乙腈600mL、纯化水60mL、50rpm搅拌下加入氨基树脂30g、加入三乙胺3mL，搅拌降温-10～-5℃b.4.5g溴丁酰溴溶于10mL乙腈中。c.控制温度-8～-2℃，将溴丁酰溴的乙腈溶液滴加入氨基树脂溶液中。滴加时间20～40min，控温-8～-2℃反应2～3h。d.抽滤，滤饼采用100mL乙腈分两次洗涤，100mL纯化水分两次洗涤，已带桥接体的载体。步骤2已带桥接体的载体和头孢菌素酰化酶的连接。a.50mL酶活100UmL头孢菌素酰化酶水溶液，搅拌加入已带桥接体的载体31g，搅拌速度30～60rpm，降温0～15℃。b.2.7mL三乙胺溶于10mL水中。c.控制反应温度0～10℃，将三乙胺水溶液滴加入头孢菌素酰化酶水溶液中，滴加时间20～40min。控温0～15℃，反应8～20h。d.抽滤，200mL纯化水分三次洗涤。得固定化头孢菌素酰化酶。固定化酶裂解实验：1000mL头孢菌素C裂解实验装置，加入30克固定化头孢菌素酰化酶，10克头孢菌素C钠盐溶于400mL水中，氨水调节PH8.5，控制温度20～25℃，采用自控加氨装置控制PH8.5～9.0，液相跟踪反应10g头孢菌素C钠剩余0.00025％时，终止反应，通过实验装置下的滤网，固定化酶留在实验装置中，继续下一批生产；滤液收集结晶制备7-氨基头孢烷酸7-ACA。所述固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果见表2。表2实施例2制备得到的固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果由表2的数据可知，本发明提供的固定化头孢菌素酰化酶活性较高，裂解20批头孢菌素C钠盐后酶活力没有出现明显下降，稳定性好。实施例3步骤1桥接体和载体的连接：a.四氢呋喃600mL、纯化水60mL、70rpm搅拌下加入氨基树脂30g、加入三乙胺3mL，搅拌降温-5～0℃。b.3.3g氯己酰氯溶于10mL四氢呋喃中。c.控制温度-5～0℃，将氯己酰氯的四氢呋喃溶液滴加入氨基树脂溶液中。滴加时间20～50min，控温-5～0℃反应2～6h。d.抽滤，滤饼采用100mL四氢呋喃分两次洗涤，100mL纯化水分两次洗涤，已带桥接体的载体。步骤2已带桥接体的载体和头孢菌素酰化酶的连接。a.50mL酶活100UmL头孢菌素酰化酶水溶液，搅拌加入已带桥接体的载体31g，搅拌速度40～70rpm，降温10～20℃。b.2.7mL三乙胺溶于10mL水中。c.控制反应温度10～20℃，将三乙胺水溶液滴加入头孢菌素酰化酶水溶液中，滴加时间20～50min，控温10～20℃反应10～20h。d.抽滤，200mL纯化水分三次洗涤。得固定化头孢菌素酰化酶。固定化酶裂解实验：1000mL头孢菌素C裂解实验装置，加入30克固定化头孢菌素酰化酶，10克头孢菌素C钠盐溶于400mL水中，氨水调节PH8.5，控制温度20-25℃，采用自控加氨装置控制PH8.5-9.0，液相跟踪反应10g头孢菌素C钠剩余0.00025％时，终止反应，通过实验装置下的滤网，固定化酶留在实验装置中，继续下一批生产；滤液收集结晶制备7-氨基头孢烷酸7-ACA。所述固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果见表3。表3实施例3制备得到的固定化头孢菌素酰化酶的性能检测结果由表3的数据可知，本发明提供的固定化头孢菌素酰化酶活性较高，裂解20批头孢菌素C钠盐后酶活力没有出现明显下降，稳定性好。由上述实施例可知，本发明提供的头孢菌素酰化酶固定化方法操作简单，获得的固定化头孢菌素酰化酶的酶活性较高，稳定性好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种头孢菌素酰化酶的固定化方法，包括以下步骤：1将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2将步骤1获得的带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的头孢菌素酰化酶；所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；所述载体为氨基树脂。2.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，所述桥接体为卤乙酰卤、卤丙酰卤、卤丁酰卤或卤戊酰卤。3.根据权利要求1或2所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，步骤1中所述滴加的时间为20～60min，所述滴加和第一缩合反应的温度独立为-10～40℃。4.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，所述桥接体与载体的质量比为0.05～0.2：1。5.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，步骤2中所述带桥接体的载体与头孢菌素酰化酶水溶液的质量比为1：1～5，所述头孢菌素酰化酶水溶液的酶活力为80～100UmL。6.根据权利要求1或5所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，步骤2中所述带桥接体的载体与三乙胺的质量比为1：0.1～0.5。7.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，步骤1中所述第一固液分离的方法为抽滤，所述抽滤后的滤饼依次用有机溶剂和水洗涤获得带桥接体的载体。8.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，所述载体溶液包括氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水；所述氨基树脂、缚酸剂、与水互溶的非质子极性溶剂和水的质量比1：0.1～0.5：5～20：2～5，所述缚酸剂为三乙胺、碳酸氢钠或碳酸钠。9.根据权利要求1所述的头孢菌素酰化酶的固定化方法，其特征在于，所述桥接体溶液中包括桥接体与溶剂，所述桥接体与溶剂的质量比为0.05～0.2：0.1～1，所述溶剂为与水互溶的非质子极性溶剂。10.权利要求1～9任意一项所述头孢菌素酰化酶的固定化方法制备获得的固定化的头孢菌素酰化酶。

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