申请/专利权人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所

申请日：2017-06-13

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107058634B

主分类号：C12Q1/70(20060101)

分类号：C12Q1/70(20060101);C12Q1/686(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2023.07.07#未缴年费专利权终止;2020.09.15#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明提供提供鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。采用了如SEQIDNO.1‑4所示的两对引物，建立能够对鸭群中鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的进行鉴别诊断的双重PCR检测方法，为鸭群中开展腺病毒感染类型的流行病学调查及科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。

主权项：1.鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物，其特征在于：所述引物如下：针对鸭腺病毒2型的特异性引物：DAdV-2F2：5’-TGGCACTACAAGACAGAA-3’，DAdV-2R2：5’-AAGCACATTTCCTACTCCAA-3’，目的片段大小为314bp；针对鸭腺病毒A型的特异性引物：DAdV-AF1：5’-TGTTGATAGCTATGATAAATTTGT-3’，DAdV-AR1：5’-AAAGTACCACTCATAATTGTA-3’，目的片段大小为580bp。

全文数据：鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒技术领域[0001]本发明提供鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。背景技术[0002]根据国际病毒分类委员会分类，腺病毒科Adenoviridae下设5个属，分别为富AT腺病毒属、禽腺病毒属、鱼腺病毒属、哺乳动物腺病毒属和唾液酸酶病毒属。腺病毒基因组全长约为33kd，基因组为线性双链DNA;该类病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称，其中腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon、纤维蛋白（Fiber和五邻体蛋白（Penton。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。[0003]鸭腺病毒2型duckadenovirus2，DAdV-2是近年来利用病毒宏基因组学发现的一种鸭源新型腺病毒，该病主要发生在20〜30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7%。但是，核苷酸同源性分析比较发现，鸭腺病毒2型GR株和鸭腺病毒A型duckadenovirusA，DAdV-A分离株在Hexon基因的核苷酸同源性约为50.0%。通过对其基于Hexon蛋白的遗传进化分析发现，所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支，且和绵羊腺病毒D型0AV287株均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型GR株和禽腺病毒A型Phelps株鸡源与P29株鹅源处于同一遗传进化分支，均属于禽腺病毒属遗传进化分支。[0004]当前，在鸭群中存在2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原:鸭腺病毒2型属于腺病毒科禽腺病毒属和鸭腺病毒A型（属于腺病毒科富AT腺病毒属），但是，当前国内外尚未见可同时对鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型进行双重PCR检测方法的引物的研宄报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。建立能够对鸭群中鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的进行鉴别诊断的双重PCR检测方法，为鸭群中开展腺病毒感染类型的流行病学调查及科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。发明内容[0005]本发明的目的在于提供鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒，建立能够对鸭群中鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的进行鉴别诊断的双重PCR检测方法，为鸭群中开展腺病毒感染类型的流行病学调查及科学防控相关疾病奠定基础。[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物，所述引物如下：针对鸭腺病毒2型的特异性引物：.DAdV-2F2:5’-TGGCACTACAAGACAGAA-3,，DAdV-2R2:5’-AAGCACATTTCCTACTCCAA-3,，目的片段大小为314bp;针对鸭腺病毒A型的特异性引物：DAdV-AFl:5’_TGTTGATAGCTATGATAMTTTGT-3,，DAdV-ARl:5，_AAAGTACCACTCATAATTGTA-3,，目的片段大小为580bp。[0007]用于检测鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的试剂盒，包括上述引物。[0008]建立50uL体系进行扩增，其中2XMultiplePCRBufferPCR扩增反应液25uL、针对引物鸭腺病毒A型的引物（10uMDAdV-AF1和DAdV-AR1各〇_8uL、针对引物鸭腺病毒2型的引物（10yMDAdV-2F2和DAdV-2R2各1_0uL、PCR扩增酶〇.25此，提取的核酸模板1•〇PL、补充灭菌去离子水至终体积50yL，混匀后进行PCR扩增。[0009]扩增条件为94°C预变性2min后进入循环，94°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。[0010]若检测样品中含有鸭腺病毒2型和鸭腺病毒，则目的片段大小有两条，分别为314bp和580bp;若检测样品中仅含有鸭腺病毒2型，则目的片段大小仅有一条，为314bp;若检测样品中仅含有鸭腺病毒A型，则目的片段大小仅有一条，为580bp;若检测样品中不存在鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型，则未见特异性条带扩增。[0011]本发明提供鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：1、同时检测：建立的方法能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染进行检测，简化操作程序、节约成本。若检测样品中含有鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型感染，则目的片段大小有两条，分别为314bp和580bp;若检测样品中仅含有鸭腺病毒2型感染，则目的片段大小仅有一条，为314bp;若检测样品中仅含有鸭腺病毒A型感染，则目的片段大小仅有一条，为58〇bp;若检测样品中不存在鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型感染，则未见特异性条带扩增。建立的双重PCR方法的灵敏度和常规PCR方法的灵敏度相当，最低为1〇敗核酸臟。[0012]2、特异性强:和鸭群中的常见传染病如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均无反应信号，仅对鸭腺病毒2型314bp和鸭腺病毒A型58〇bp检测出现特异性扩增条带。[0013]对79份临床送检鸭源病料按照常规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPureViralDNARNAKit货号:ER201-01，北京全式金生物技术有限公司）提取相应的核酸DNA，利用建立的双重PCR方法进行鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型感染的检测。结果可见，检测到2份鸭腺病毒2型感染阳性，阳性率为2.53%;检测到5份鸭腺病毒A型感染阳性，阳性率为6•33%;检测到1份鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型共感染阳性，阳性率为i.27%。附图说明[0014]图1多重PCR电泳结果，其中，M:DNA分子量DL2000;1:鸭腺病毒2型；2:鸭腺病毒A型;3:鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型共感染;4:鸭大肠杆菌;5:鸭疫里氏杆菌;6:鸭源禽多杀性巴氏杆菌;7:鸭瘟病毒;8:番鸭细小病毒;9:阴性对照。[0015]图2针对鸭腺病毒2型的特异性试验，其中，M:DNA分子量DL2〇00;l:鸭腺病毒2型；2:鸭腺病毒A型;3:鸭大肠杆菌;4:鸭疫里氏杆菌;f5:鸭源禽多杀性巴氏杆菌;6:鸭瘟病毒；7:番鸭细小病毒;8:阴性对照。[0016]图3针对鸭腺病毒A型的特异性试验，其中，M:DNA分子量DL2000;1:鸭腺病毒2型；2:鸭腺病毒A型;3:鸭大肠杆菌;4:鸭疫里氏杆菌;5:鸭源禽多杀性巴氏杆菌;6:鸭瘟病毒；7:番鸭细小病毒;8:阴性对照。’[0017]图4双重PCR的灵敏度试验，其中，M:DNA分子量DL2000;1:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（105pg核酸DNA;2:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（104pg核酸DNA;3:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（103pg核酸DNA;4:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（102pg核酸DNA;5:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（lObg核酸DNA;6:鸭腺病毒2型鸭腺病毒A型（10Qpg核酸DNA;7::阴性对照。具体实施方式[0018]实施例i1、材料与方法1.1毒株和菌株试验用病原鸭腺病毒2型、鸭腺病毒A型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研宄所鉴定和保存。[0019]1.2引物的设计根据美国国家生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI数据库GenBank上腺病毒科富AT腺病毒属鸭腺病毒2型和腺病毒科禽腺病毒属鸭腺病毒A型编码的hexon基因特点，应用引物设计软件〇lig0版本号¥7.37分别设计针对鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的特异性引物，序列如下，引物均在宝日医生物技术北京有限公司合成。[0020]针对鸭腺病毒2型的特异性引物：DAdV-2F2:5，-TGGCACTACAAGACAGM-3,；DAdV-2R2:5’-MGCACATTTCCTACTCCAA-3’；目的片段大小为314bp。[0021]针对鸭腺病毒A型的特异性引物：DAdV-AFl:5’-TGTTGATAGCTATGATAAATTTGT-3’；DAdV-AR1:5’-AAAGTACCACTCATAATTGTA-3’；目的片段大小为580bp。[0022]上述引物均由宝日医生物技术北京有限公司合成。[0023]1.3双重PCR方法建立按照病毒核酸提取试剂盒EasyPureViralDNARNAKit提取鸭腺病毒2型FJ20171株和鸭腺病毒A型JX2016株核酸DNA。根据多重PCR试剂盒推荐的50uL体系进行扩增，其中2XMultiplePCRBufferPCR扩增反应液25uL、l〇uM针对引物鸭腺病毒2型的引物①AdV-2F2和DAdV-2R2各1.0uL、10uM针对引物鸭腺病毒A型的引物DAdV-AF1和DAdV-AR1各0.8UL、PCR扩增酶0.25乩，提取的核酸模板鸭腺病毒2型FJ20171株基因组DNA和鸭腺病毒A型JX2016株基因组DNA各1.0此、补充灭菌去离子水至终体积50此，混匀后进行PCR扩增。[0024]扩增条件为94°C预变性2min后进入循环，94r变性30s、56。：退火30s、72延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。[0025]结果见图1:鸭腺病毒2型的目的片段大小为314bp;鸭腺病毒A型的目的片段大小为580bp;而鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型混合感染目的片段大小有两条，分别为314如和580bp;鸭大肠杆囷、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭痕病毒和番鸭细小病毒均未见特异性条带扩增。[0026]1.4特异性试验按照病毒核酸提取试剂盒EasyPureViralDNARNAKit提取鸭瘟病毒和番鸭细小病毒核feDNA。按照基因组提取试剂盒EasyPureGenomicDNAKit提取鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌基因组DNA。以提取的鸭腺病毒A型JX2016株和鸭腺病毒2型FJ20171株核酸DNA为阳性对照。[0027]1.4.1针对鸭腺病毒2型的特异性试验利用针对引物鸭腺病毒2型的引物DAdV-2F2和DAdV-2R2进行常规PCR扩增，根据PCR试剂盒（2XEasyTaqPCRSuperMix+dye推荐的50uL体系进行扩增，其中2XEasyTaqPCRSuperMixBufferPCR扩增反应液25uL、10uM针对引物鸭腺病毒△型的引物DAdV-2FfPDAdV-2R2各1此、提取的核酸模板提取的核酸DNA均分别试验）1此、补充灭菌去离子水至终体积50uL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94°C预变性5min后进入循环，94°C变性50s、56°C退火30s、72。：延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。^[0028]结果见图2:鸭腺病毒2型的目的片段大小为314bp;鸭腺病毒A型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均未见特异性条带扩增。[0029]1•4•2针对鸭腺病毒A型的特异性试验。利用针对引物鸭腺病毒A型的引物DAdV-AF1和DAdV-AR1进行常规PCR扩增，根据PCR试剂盒（2XEasyTaqPCRSuperMix+dye推荐的50uL体系进行扩增，其中2XEasyTaqPCRSuperMixBufferPCR扩增反应液25yL、10yM针对引物鸭腺病毒A型的引物DAdV-AF1和DAdV-AR1各luL、提取的核酸模板提取的核酸DNA均分别试验）i.〇wL、补充灭菌去离子水至终体积50uL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94。：预变性5min后进入循环，94°C变性50s、56°C退火30s、72。：延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。[0030]结果见图3:鸭腺病毒A型的目的片段大小为58〇bp;鸭腺病毒2型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均未见特异性条带扩增。[0031]1_4_3建立的双重PCR方法的特异性试验根据多重PCR试剂盒MultiplexPCRAssayKitVer_2推荐的50wL体系进行扩增，其中2XMultiplePCRBufferPCR扩增反应液25uL、10yM针对引物鸭腺病毒A型的引物①AdV-AF1和DAdV-AR1各0_8uL、10uM针对引物鸭腺病毒2型的引物DAdV-2F2和DAdV-2R2各1_0ixL、PCR扩增酶0.25此，提取的核酸模板提取的核酸DNA均分别试验）1•0此、补充灭菌去离子水至终体积5〇此，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94t预变性2min后进入循环，94°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。[0032]结果见图1:鸭腺病毒2型的目的片段大小为314bp;鸭腺病毒六型的目的片段大小为58〇bp;而鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的目的片段大小有两条，分别为314如和58〇如;鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆囷、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均未见特异性条带扩增。[0033]1.4.4建立的双重PCR方法的敏感性性试验根据多重PCR试剂盒MultiplexPCRAssayKitVer.2推荐的5〇uL体系进行扩增，其中2XMultiplePCRBufferPCR扩增反应液25此、1〇福针对引物鸭腺病毒a型的引物DAdV-AF1和DAdV-AR1各0.8yL、10福针对引物鸭腺病毒2型的引物Mdv_2以和DAdV-2_R2各1•0yL、PCR扩增酶〇•邓此，提取的核酸模板提取的核酸^^测定其㈤值后，分别进行连续倍比稀释，均分别试验）1.0此、补充灭菌去离子水至终体积5〇此，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94°C预变性2min后进入循环，M°C变性30s、56。：退火30s、72C延伸40s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。[0034]结果见图4:检测鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的最低检测限均为i〇Pg基因组核酸DNA，表明建立的双重PCR方法，在检测灵敏度上和常规PCR相当。[0035]1.5临床试验对79份临床送检鸭源病料按照1¾规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPureViralDNARNAKit货号:ER201-01，北京全式金生物技术有限公司）提取相应的核酸DNA，利用建立的双重PCR方法进行鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型感染的检测。结果可见，检测至IJ2份鸭腺病毒2型感染阳性，阳性率为2.53%;检测到5份鸭腺病毒A型感染阳性，阳性率为6.33%;检测到1份鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型共感染阳性，阳性率为1.27%。[0036]将双重PCR反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒DP209，天根生化科技北京有限公司）分别进行切胶回收。按照pEASY-TlSimpleCloningKit克隆连接试剂盒（CT111-01，北京全式金生物技术有限公司）说明书将基因片段克隆到pEASY-Tl载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素含量为1〇〇ugmL抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒DP105,天根生化科技北京有限公司）提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物[针对引物鸭腺病毒A型的引物DAdV-AF1和DAdV-AR1、针对引物鸭腺病毒2型的引物①AdV-2F2和DAdV-2R2]和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术北京有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型Hexon基因片段，和双重PCR检测的符合率为100%。[0037]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

权利要求：1.鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重pCR检测引物，其特征在于:所述引物如下：针对鸭腺病毒2型的特异性引物：DAdV-2F2:5’-TGGCACTACAAGACAGAA-3’，DAdV-2R2:5’-AAGCACATTTCCTACTCCAA-3,，目的片段大小为314bp;针对鸭腺病毒A型的特异性引物：DAdV-AFl:5’-TGTTGATAGCTATGATMATTTGT-3,，DAdV-ARl:5’_AAAGTACCACTCATAATTGTA-3’，目的片段大小为580bp。2.用于检测鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

百度查询： 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 鸭腺病毒2型和鸭腺病毒A型双重PCR检测引物及试剂盒

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