申请/专利权人：西安科技大学

申请日：2017-07-11

公开（公告）日：2020-09-22

公开（公告）号：CN107281309B

主分类号：A61K36/80(20060101)

分类号：A61K36/80(20060101);A61P3/10(20060101);G01N24/08(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.22#授权;2017.11.24#实质审查的生效;2017.10.24#公开

摘要：本发明公开了一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法及其在降糖药物中的应用，对芯芭采用混合溶剂直接萃取，利用NMR技术定性和定量分析芯芭提取物中环烯醚萜苷类化合物的含量，解决了现有技术中的提取分离效率低、药效组分含量测定误差较大及步骤繁琐的技术问题。本发明分离的含有环烯醚萜苷类化合物的提取物具有显著的体内降糖效果，在STZ、四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型中，能显著改善糖尿病小鼠的糖耐受，可以在降糖药物制备中应用。

主权项：1.一种芯芭中环烯醚萜及环烯醚萜苷类化合物的分离、分析方法，其特征在于：包括以下步骤：1分离：将芯芭粉碎，得芯芭粉；将芯芭粉用由乙酸乙酯、丙酮及甲醇组成的混合溶剂超声提取，提取完毕后过滤，得提取液，所述混合溶剂中乙酸乙酯:丙酮:甲醇的体积比为1:0.2～0.6:0.2～0.6；将提取液依次经浓缩、冷冻干燥，得到芯芭提取物；2分析：将芯芭提取物溶解于氘代试剂后再加入内标物，制备得到分析样品，然后采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品分析；3根据采样得到的氢共振信号，选取与环烯醚萜及环烯醚萜苷类化合物的特征结构对应的信号峰和内标物的特征信号峰，采用内标法定量计算环烯醚萜及环烯醚萜苷类化合物的含量；所述特征结构对应的信号峰为δ6.24～6.38ppm的dd、t或m峰；所述采样中，脉冲序列的角度为30～90度，弛豫时间≥5s，探头温度为20～40℃，扫描次数为32～1024次，谱峰宽度为10～20ppm。

全文数据：芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法及其在降糖药物中的应用技术领域[0001]本发明属于中药学领域，涉及芯芭活性组分环烯醚萜苷类化合物（即环烯醚萜及环烯醚萜苷类化合物总称的分离、分析及其在制备降糖药物中的应用。背景技术[0002]芯色，蒙药名“阿拉坦-阿给”，是玄参科（Scrophulariaceae植物达乌里芯色CymbariadahuricaL.和蒙古芯色CymbariamongolicaMaxim.的干燥全草。《中华本草》蒙药卷记载芯芭已有七百多年应用历史，在四味芯芭散、八味芯芭散等经典蒙药处方中做主药或配方使用。李旻辉等发现芯芭正丁醇提取物能够剂量依赖的降低四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠血糖水平，而芯芭水提取物和低剂量正丁醇提取物对血糖影响较小。武小兰等人的研究表明高剂量芯芭正丁醇提取物组小鼠的空腹胰岛素水平FINS明显高于模型组小鼠（P〈0.05，而低剂量正丁醇组和水剂量组小鼠对FINS影响较小。提示芯芭正丁醇提取部分可能含有降糖活性组分，但是提取方法复杂和药效物质含量不清楚等限制了其进一步应用。[0003]有文献报道以梓醇为代表的环烯醚萜苷类化合物有较好的降糖效果，可能是芯芭中的降糖活性物质。然而现有技术、方法对于环烯醚萜苷类化合物的分离和分析均费时、费力。如王鸿宇等采用95%乙醇回流后热水分散，再用正丁醇萃取。HPLC于210nm处外标法检测含量。该提取方法适合于天然产物中的小分子化合物的分离，针对性较差，提取方法复杂、总效率低。同时，因为环烯醚萜苷类化合物特殊的结构，定量分析的难度非常大:如用外标法则需要每一种环烯醚萜苷类化合物的标准样品，难度极高;如用内标法，则因为其紫外吸收较弱，误差很大。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种芯芭中环烯醚萜类化合物的快速分离、分析方法及其在降糖药物中的应用。[0005]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：[0006]—种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，包括以下步骤：[0007]1分离：将芯芭粉碎，得芯芭粉;将芯芭粉用由乙酸乙酯、丙酮及甲醇组成的混合溶剂超声提取，提取完毕后过滤，得提取液，所述混合溶剂中乙酸乙酯:丙酮：甲醇的体积比为1:0.2〜0.6:0.2〜0.6;将提取液依次经浓缩、冷冻干燥，得到芯芭提取物；[0008]2分析:将芯芭提取物溶解于氘代试剂后再加入内标物，制备得到分析样品，然后采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品分析；[0009]3根据采样得到的氢共振信号，选取与环烯醚萜苷类化合物的特征结构对应的信号峰和内标物的特征信号峰，采用内标法定量计算环烯醚萜苷类化合物的含量。[0010]所述超声提取的条件为：提取温度为20〜60°C，提取时间为15〜60min，超声功率为60〜200W;所述混合溶剂用量以IOOg芯芭计为400〜lOOOmL。[0011]所述浓缩的条件为:温度为30〜60°C，压力为-0.08〜-O.IMPa，浓缩至无溶剂流出为止;所述冷冻干燥的条件为:冷冻温度为-80〜-20°C，干燥真空度为-0.09〜-0.IMPa。[0012]所述氘代试剂选自CDCl3、DMS〇-d6、CD3OD、CD3⑶CD3或THF-d8，分析样品制备中，氘代试剂用量为0.3〜0.6mL，芯芭提取物用量为5〜100mg。[0013]所述内标物选自间苯三酚、对苯二甲酸二甲酯、顺丁烯二酸、反式二氯乙烯、2,3，4,5_四氯苯中的一种或两种组合;所述内标物在加入前预先用所述氘代试剂制成溶液，该溶液的用量为1〜IOyL，且内标物总浓度为0.01〜IM。[0014]所述特征结构对应的信号峰为δ6.24〜6.38ppm的dd、t或m峰。[0015]所述采样中，脉冲序列的角度为30〜90度，弛豫时间多5s，探头温度为20〜40°C，扫描次数为32〜1024次，谱峰宽度为10〜20ppm。[0016]所述环烯醚萜苷类化合物在所述芯芭提取物中的摩尔含量按照以下公式计算：[0017]海=c标XV标XA活Xf标A|示Xf活）=IVfeXA活Xf标A|示Xfg1[0018]公式⑴中，M活为环烯醚萜苷类化合物的摩尔数;Μ»为内标物的摩尔数;c标为所加内标物的摩尔浓度，V标为所加内标物的体积数;A活为所述特征结构对应的信号峰的峰面积;Α»为选取的内标物特征信号峰的峰面积，f标为单位摩尔数内标物特征信号峰的峰面积，f活为单位摩尔数环烯醚萜苷类化合物特征结构对应的信号峰的峰面积。[0019]—种芯芭提取物，所述芯芭提取物按照上述芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离步骤1制备得到：[0020]上述芯芭提取物在制备降糖药物中的应用，所述芯芭提取物的给药剂量为20〜400mgkg天。[0021]上述芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法在制备降糖药物中的应用。[0022]本发明的有益效果体现在：[0023]本发明采用混合溶剂超声辅助萃取，然后经浓缩、冷冻干燥得到芯芭提取物，结合NMR技术，选择环烯醚萜苷类化合物的特征氢信号定性判断，定量采用内标法，从而实现芯芭提取物中环烯醚萜苷类化合物的快速定性和定量分析，给出芯芭提取物中环烯醚萜苷类化合物的摩尔含量，不仅分离效率高，而且分析结果可靠，为后续生化测定和药物筛选提供强有力的帮助。[0024]进一步的，本发明利用NMR可以对化合物中不同结构进行定性和定量的特点，通过内标法对环烯醚萜苷类化合物区别于芯芭中其他活性物质的化学结构特征进行定量分析，能够在未知化合物或混合物摩尔分子量的前提下快速、准确的给出环烯醚萜苷类化合物的摩尔含量，解决了针对具有相同特征结构的同一类天然活性物质，即环烯醚萜苷）类化合物的快速、准确定量分析的问题，有利于活性筛选的定量比较。[0025]进一步的，本发明通过内标物信号峰和被测组分中特征结构的信号峰的峰面积比值来定量分析被测组分，结合中药指纹图谱数据，所筛选的内标物具有芯芭中天然活性物质不具备的结构特征，从而不与芯芭中天然活性物质信号峰重叠定量计算时需要进行峰面积求取，部分重叠以及全部重叠的信号峰无法用于定量，故要求二者的信号峰能够分开），而且内标物自身的化学位移值仅对应一个吸收峰，可以在内标物用量限制下实现被测组分的快速、准确定量分析。[0026]进一步的，本发明通过优化脉冲序列中的角度、弛豫时间、扫描次数、探头温度等参数，使得本发明对环烯醚萜苷类化合物的定量普遍适用，消除了信号峰飘移对定量结果的影响，不必要求内标物信号峰与环烯醚萜苷类化合物特征结构的信号峰在峰位置上接近，使活性组分定量更为灵活、更为准确。[0027]本发明所述芯芭提取物含有环烯醚萜苷类化合物，经实验证实该芯芭提取物在连续给药方式下能够有效改善糖耐受，表明长时间给药其体内降糖效果更明显并且剂量较现有芯芭提取物例如正丁醇提取显著降低，在制备降糖药物中具有更广泛的应用前景。附图说明[0028]图1是STZ诱导的II型糖尿病小鼠的OGTT实验结果。[0029]图2是四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠的OGTT实验结果。具体实施方式[0030]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。[0031]一芯芭超声提取[0032]取100克芯芭含水率低于0.5%，粉碎，过20目筛，得粗粉，将粗粉加入400mL混合溶剂（乙酸乙酯200mL+丙酮IOOmL+甲醇lOOmL，1:0.5:0.5，在40°C的水浴中超声提取60min超声功率150W，过滤，将提取液（即滤液）浓缩（60°C，-0.IMPa后冷冻干燥（-80°C，-0.09MPa得到提取物8.6g，总提取率为8.6%。[0033]二芯芭中环烯醚萜苷类化合物的定性和定量分析[0034]取25mg上述提取物溶于0.5mLCDCl3中，再加入IM的间苯三酚标准溶液（溶剂为CDCl35yL，得样品，BrukerAM400MHz测定样品的氢共振信号，探头温度控制为24°C，调用1HNMR中的脉冲序列zg脉冲角度为90度），重新定义弛豫时间dl=5s，扫描次数ns=64;其他参数为序列中的标准参数例如，谱峰宽度为20ppm。环烯醚萜苷类化合物的定性采用其特征氢共振信号36.32ppm的多重峰（S卩m峰）16.7mmolL者为糖尿病小鼠，第4天进行药物筛选实验。[0053]药物筛选实验:取建模成功的小鼠，采用50mgkg的剂量灌胃给药提取物），3次天，给药时长为3天、8天和15天（即3d组、8d组、15d组）；给药后自由饮水，禁食12h，以2gkg体重量的葡萄糖剂量灌胃，STZ组（模型对照，只给生理盐水）和阳性对照药物组Metformin，5mmolkg，15天）以同样方式给予葡萄糖。用血糖仪分别在0、0.5、1、1.5、2h后测定血糖BG;用药时曲线下面积AUC来反映糖耐量。同时，检测STZ组和阳性对照药物组Metformin血糖。[0054]测试结果及数据分析见图1，与正常对照组和阳性对照药物组比较，连续给药提取物方式能够有效改善糖耐受。[0055]3.四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠验证提取物连续给药的降糖能力[0056]模型构建及药物筛选方法参考文献报道的标准方法，简述为：取C57BL6小鼠40只，抽签法分为模型组n=25和正常对照组n=5。模型组禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧啼啶011«3118〇11^1^溶剂:〇.〇11]1〇1凡4!14.2的枸橡酸缓冲液），1次4天，连续4次。正常对照组禁食不禁水12h后腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。最后一次注射后1周内，断尾取血测量血糖。连续3天血糖16.7mmolL者为I型糖尿病小鼠，第4天进行药物筛选实验。[0057]药物筛选实验：取建模成功的小鼠，采用25mgkg、50mgkg和100mgkg的剂量灌胃给药提取物），2次天;给药时长为连续6周，6周后自由饮水，禁食12h，以3gkg体重量的葡萄糖剂量灌胃，AlIoxan组（模型对照，只给生理盐水）和阳性对照药物组（Metformin，5mmolkg，6周）以同样方式给予葡萄糖。用血糖仪分别在0、0.5、1、1.5、2h后测定血糖BG;用药时曲线下面积AUC来反映糖耐量。同时，检测Alloxan组和阳性对照药物组血糖。[0058]测试结果及数据分析见图2,与正常对照组和阳性对照药物组比较，连续给药（提取物方式能够有效改善糖耐受。提取物能够剂量依赖的对四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠发挥一定的治疗作用;高剂量时（l〇〇mgkg，其降糖能力与阳性对照药物相当。[0059]根据以上实验，本发明从蒙药芯芭中分离的提取物能够改善糖尿病小鼠的糖耐受，特别是长时间连续给药，针对I型和II型糖尿病，其降糖效果都非常明显，提取物中能够作为降糖药物或候选药物。

权利要求：1.一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:包括以下步骤：1分离：将芯芭粉碎，得芯芭粉;将芯芭粉用由乙酸乙酯、丙酮及甲醇组成的混合溶剂超声提取，提取完毕后过滤，得提取液，所述混合溶剂中乙酸乙酯:丙酮：甲醇的体积比为1:0.2〜0.6:0.2〜0.6;将提取液依次经浓缩、冷冻干燥，得到芯芭提取物；2分析:将芯芭提取物溶解于氘代试剂后再加入内标物，制备得到分析样品，然后采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品分析；3根据采样得到的氢共振信号，选取与环烯醚萜苷类化合物的特征结构对应的信号峰和内标物的特征信号峰，采用内标法定量计算环烯醚萜苷类化合物的含量。2.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述超声提取的条件为:提取温度为20〜60°C，提取时间为15〜60min，超声功率为60〜200W;所述混合溶剂用量以IOOg芯芭计为400〜1000mL。3.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述浓缩的条件为:温度为30〜60°C，压力为-0.08〜-0.IMPa，浓缩至无溶剂流出为止;所述冷冻干燥的条件为:冷冻温度为-80〜-20°C，干燥真空度为-0.09〜-0.IMPa。4.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述氘代试剂选自CDCl3、DMS〇-d6、CD3OD、CD3COCD3或THF-d8，分析样品制备中，氘代试剂用量为0.3〜0.6mL，芯芭提取物用量为5〜100mg。5.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述内标物选自间苯三酚、对苯二甲酸二甲酯、顺丁烯二酸、反式二氯乙烯、2,3,4，5-四氯苯中的一种或两种组合;所述内标物在加入前预先用所述氘代试剂制成溶液，该溶液的用量为1〜l〇yL，且内标物总浓度为0.01〜1M。6.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述特征结构对应的信号峰为δ6.24〜6.38ppm的dd、t或m峰。7.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述采样中，脉冲序列的角度为30〜90度，弛豫时间多5s，探头温度为20〜40°C，扫描次数为32〜1024次，谱峰宽度为10〜20ppm。8.根据权利要求1所述一种芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法，其特征在于:所述环烯醚萜苷类化合物在所述芯芭提取物中的摩尔含量按照以下公式计算：M活=示XA活Xf标Af示Xf活）公式中，M活为环烯醚萜苷类化合物的摩尔数;Μ»为内标物的摩尔数;A活为所述特征结构对应的信号峰的峰面积;A«为选取的内标物特征信号峰的峰面积，f标为单位摩尔数内标物特征信号峰的峰面积，f活为单位摩尔数环烯醚萜苷类化合物特征结构对应的信号峰的峰面积。9.一种芯芭提取物，其特征在于:所述芯芭提取物的制备方法包括以下步骤：将芯芭粉碎，得芯芭粉；将芯芭粉用由乙酸乙酯、丙酮及甲醇组成的混合溶剂超声提取，提取完毕后过滤，得提取液，所述混合溶剂中乙酸乙酯:丙酮：甲醇的体积比为1:0.2〜0.6:0.2〜0.6;将提取液依次经浓缩、冷冻干燥，得到芯芭提取物。10.—种如权利要求1所述的芯芭中环烯醚萜苷类化合物的快速分离、分析方法在制备降糖药物中的应用。

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