申请/专利权人：江苏省原子医学研究所

申请日：2017-07-27

公开（公告）日：2020-10-20

公开（公告）号：CN107217105B

主分类号：C12Q1/6886(20180101)

分类号：C12Q1/6886(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.20#授权;2017.10.27#实质审查的生效;2017.09.29#公开

摘要：本发明提供了一种癌症联合诊断标记物，包括lncRNAH19和lncRNAPTCSC3；以及癌症联合诊断标记物在制备癌症诊断、癌症预后评估或癌症治疗监测的试剂中的应用。lncRNAH19和lncRNAPTCSC3作为癌症的联合诊断标志物中具有灵敏度高、特异性强和检测结果准确的优点，能够应用于癌症样本的分类。本发明还提供了用于癌症诊断的引物、检测探针和检测芯片，以及包括上述内容的试剂盒。通过利用引物、检测探针、检测芯片或试剂盒分别检测样本中lncRNAH19和lncRNAPTCSC3的表达量，能够实现对甲状腺癌淋巴结转移的有效判定，为甲状腺癌的诊断、预后评估和疗效监测提供可靠信息。

主权项：1.一种检测癌症联合诊断标记物的引物组或检测探针组在制备癌症诊断试剂中的用途，其特征在于，所述癌症联合诊断标记物为lncRNAH19和lncRNAPTCSC3；所述癌症诊断为乳头状甲状腺癌淋巴结转移。

全文数据：一种癌症联合诊断标记物及其用途技术领域[0001]本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种癌症联合诊断标记物、癌症联合诊断标记物的用途，和基于其设计的引物、检测探针、检测芯片和试剂盒。背景技术[0002]甲状腺癌（thyroidcarcinoma是最常见的甲状腺恶性肿瘤，是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤。其发病率约占全身恶性肿瘤的1.3%-1.5%，在内分泌系统疾病中排第一，是临床上的常见病、多发病，且保持逐年升高趋势。绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞，按病理类型可分为乳头状癌（60%、滤泡状腺癌（20%、未分化癌（15%、髓样癌7%。其中乳头状癌较早出现颈淋巴结转移，但预后较好;滤泡状腺癌肿瘤生长较快，属中度恶性，易经血运转移;未分化癌预后很差，平均存活时间3-6个月。甲状腺癌的诊断与鉴别诊断目前仍是困扰临床医师的一个重要课题。随着甲状腺癌分子诊断的发展，对分化型甲状腺癌的个性化治疗渐渐走入人们的视线。然而目前在甲状腺癌中发现的一系列指征肿瘤状态的分子指标，例如:BRAF突变，RASKRAS，HRAS，NRAS和RE-PTC重排并不足以满足临床上的需求。[0003]甲状腺癌的发病率与死亡率之间存在较大差异，甲状腺癌的病情进展相对缓慢，生存时间较长，多数甲状腺癌患者预后较好，但仍有少数甲状腺癌患者因肿瘤局部侵犯，或肿瘤远处转移而最终死于甲状腺癌。以最常见的乳头状甲状腺癌为例，其预后大多良好，但是术后10年的复发转移风险仍有约30%，并且发病机制尚不清楚。甲状腺癌转移方式一般包括三种，甲状腺癌内扩散:癌细胞沿组织间隙、淋巴管、血管侵入邻近正常的甲状腺组织；淋巴结转移:癌细胞沿胸锁乳突肌深部在颈内静脉周围及喉前、气管前淋巴结转移，患侧病变亦可转移至对侧颈淋巴结，或纵隔淋巴结或全身淋巴结;血行转移:癌细胞进入血液循环转移至全身，如肺、肝、胸腔、骨骼等处。乳头状甲状腺癌作为甲状腺癌的常见类型，其颈淋巴转移率为20%-90%。淋巴结转移的诊断与治疗在甲状腺癌诊治中具有广泛的应用价值。[0004]在人类基因组的转录本当中，90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力，他们往往被转录成非编码RNAnon-codingRNA，ncRNA。依据核苷酸的长度，我们把ncRNA又分为两大类:分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码RNA和核苷酸长度大于200nt的长链非编码RNAIncRNA。IncRNA—度曾被认为是基因转录时的“噪音”和“垃圾”，并不具有特定的生物学功能。随着这些年的研究发现，IncRNA在多种类型肿瘤细胞的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的作用，同时由于IncRNA具有显著的肿瘤组织特异性，为癌症临床诊断提供了无创、快捷和低成本的筛查手段。随着IncRNA研究的兴起，人们开始关注甲状腺癌中IncRNA的表达及调控方式，以期完善对甲状腺的发生发展机制的理解，实现精准医疗的目标。[0005]长链非编码RNA是肿瘤早期诊断和基因治疗研究的热点，找到甲状腺癌异常表达的长链非编码RNA并将其应用于诊断，具有非常重要的实用价值。[0006]《长链非编码RNAH19对促进甲状腺癌转移的影响》王龙强，武汉市中心医院甲状腺乳腺外科，中华实验外科杂志，2015观察到了一种长链非编码RNAIncRNAH19在甲状腺癌的进展过程中的影响。H19通过提供miR-675,结合于⑶H13基因，阻断⑶H13表达，进而促进甲状腺癌细胞的侵袭和迀移能力。《Alongnon-codingRNA，PTCSC3,asatumorsuppressorandatargetofmiRNAsinthyroidcancercells〉〉鉴定了非编码RNA乳头状甲状腺癌易感性候选物3lncRNAPTCSC3。该IncRNA转染甲状腺癌细胞后可引起甲状腺癌细胞增殖抑制，细胞周期阻滞和细胞凋亡增加。上述文献分别阐述了IncRNAH19或lncRNAPTCSC3作为甲状腺癌的分子诊断标记物的潜能，但是无论是lncRNAH19还是lncRNAPTCSC3，将其单独应用于甲状腺癌检测时，都存在检测的灵敏度低、特异性差的问题，在甲状腺癌的转移诊断中，易出现假阳性或假阴性，无法有效应用于甲状腺癌的诊断、预后评估或疗效监测，为临床癌症诊断和治疗提供可靠信息。发明内容[0007]为此，本发明要解决的技术问题在于解决现有技术中甲状腺癌的检测标记物检测灵敏度低、特异性差，无法为甲状腺癌的诊断、预后评估或疗效监测提供有效信息；从而提供一种灵敏度高、特异性强的癌症联合诊断标记物。[0008]本发明提供了一种癌症联合诊断标记物，所述癌症联合诊断标记物包括IncRNA!119和111。1?熟？1^5〇3。[0009]所述的癌症联合诊断标记物，所述lncRNAH19的CDNA序列如SEQIDNO.1所示，所述lncRNAPTCSC3的cDNA核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。[0010]本发明提供了上述的癌症联合诊断标记物在制备癌症诊断、癌症预后评估和或癌症治疗监测的试剂中的用途。[0011]所述的用途，所述癌症为甲状腺癌。[0012]所述的用途，所述癌症诊断为甲状腺癌淋巴结转移诊断。[0013]本发明提供了一种用于癌症诊断的引物组，所述引物组包括基于上述的癌症联合诊断标记物设计的引物。[0014]所述的引物组，所述引物组包括如下所述引物：[0015]lncRNAH19-F，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示；[0016]lncRNAH19-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；[0017]lncRNAPTCSC3-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；[0018]lncRNAPTCSC3-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。[0019]lncRNAH19-F’，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；[0020]lncRNAH19-R’，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；[0021]lncRNAPTCSC3-F’，其核苷酸序列如SEQIDN0·9所示；[0022]lncRNAPTCSC3-R’，其核苷酸序列如SEQIDN0.10所示。[0023]本发明提供了一种用于癌症诊断的检测探针组，所述检测探针组包括基于所述的癌症联合诊断标记物设计的检测探针。[0024]所述的检测探针组，所述检测探针组包括如下所述探针：[0025]lncRNAH19-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；[0026]lncRNAPTCSC3-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。[0027]所述的检测探针组，所述检测探针的5’端连接有报告荧光基团，3’端连接有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、HEX或Cy5,所述淬灭荧光基团选自TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。[0028]本发明提供了一种用于癌症诊断的检测芯片，所述检测芯片包括上述的检测探针。[0029]本发明提供了一种用于癌症诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物、所述的检测探针和或所述的检测芯片。[0030]所述的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：[0031]1提取样本总RNA，将总RNA反转录为cDNA;[0032]2以cDNA作为qPCR的模板，应用所述引物、所述检测探针或所述的检测芯片，分别检测样本中所述IncRNAH19和所述IncRNAPTCSC3的表达量。[0033]所述的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法，所述样本选自肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体。[0034]本发明相对现有技术具有如下优点：[0035]1本发明提供的癌症联合诊断标记物，包括IncRNAH19和IncRNAPTCSC3。通过分别检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量，然后利用数学方法得到两者的联合检测预测值，以联合检测预测值为变量，根据不同阈值（即变量值对癌症诊断的特异性和灵敏度绘制ROC曲线，并计算AUC值，最终根据AUC值、灵敏度和特异性对癌症样本进行分类，应用于癌症的诊断;将IncRNAH19和IncRNAPTCSC3作为标记物对癌症进行联合检测，其检测的特异性强、灵敏度高，能够有效避免单独以IncRNAH19或IncRNAPTCSC3基因作为癌症检测标记物时易出现的假阳性或假阴性结果，为癌症的诊断、预后或疗效监测提供可靠信息。[0036]2本发明提供的癌症联合诊断标记物能够应用于制备癌症诊断、癌症预后评估和或癌症治疗监测的试剂，其中所述的癌症为甲状腺癌，所述的癌症诊断为甲状腺癌的淋巴结转移诊断。利用IncRNAH19和IncRNAPTCSC3基因所制备的试剂，在应用于甲状腺癌患者检测时具有准确度高的优点，能够为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌预后，以及治疗效果的评估提供重要的参考信息，便于提供及时、针对性的治疗，提高患者的存活率和生存质量。[0037]3本发明提供了用于癌症诊断的引物组，是基于癌症联合诊断标记物设计的，能够特异性检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3基因在细胞或组织中的表达水平，进而可以对甲状腺癌淋巴结转移进行诊断，检测的准确度高。[0038]4本发明提供的检测探针为荧光标记的探针，能够采用qPCR技术对IncRNAH19和IncRNAPTCSC3基因进行定量检测，具有特异性和灵敏度高、时间短、操作简单及效率高的优点。[0039]5本发明提供的癌症诊断的检测芯片，包括上述的检测探针，将其应用于检测甲状腺癌患者体内IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达情况，具有检测特异性高、灵敏度强，以及适用于大通量筛查的优点。[0040]6本发明提供的癌症诊断的试剂盒，包括上述的引物组、上述的检测探针和或上述的检测芯片，能够特异性检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3基因的表达情况，检测结果准确度高，在甲状腺癌淋巴结转移、预后和疗效监测中具有较高的应用价值。[0041]7本发明提供的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法，在样本检测中的用途，其中的检测样本能够取自外周血、尿液、唾液或眼泪等，具有取材方便、创伤小或无创伤，以及安全等优点。附图说明[0042]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0043]图1为本发明实施例1中所检测的IncRNAH19和IncRNAPTCSC3在甲状腺癌淋巴结非转移和转移患者中不同的表达水平；[0044]图2为本发明实施例2中所检测的IncRNAH19和IncRNAPTCSC3在甲状腺癌淋巴结非转移和转移患者中不同的表达水平；[0045]图3为本发明实施例3中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3联合检测的ROC曲线；[0046]图4为本发明对比例1中IncRNAH19单独检测的ROC曲线、IncRNAPTCSC3单独检测的ROC曲线，以及IncRNAH19和IncRNAPTCSC3联合检测的ROC曲线；[0047]图5为本发明对比例2中IncRNABANCR单独检测的ROC曲线，以及IncRNABANCR和PTCSC3联合检测的ROC曲线；[0048]图6为本发明对比例3中IncRNABANCR、H19和PTCSC3联合检测的ROC曲线；具体实施方式[0049]以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，所有引物合成由（生工生物工程上海股份有限公司）完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如反转录试剂盒购自TAKARA，SYBR购自TAKARAo[0050]实施例1[0051]本实施例提供一种测定样本中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3表达量的方法，具体包括以下步骤：[0052]1、样本的采集[0053]在江苏省原子医学研究所附院江原医院随机采取41例乳头状甲状腺癌患者的手术后组织样本，选取其肿瘤组织以及距离肿瘤组织Icm以上的组织作为肿瘤临近正常组织，分别检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量。[0054]2、检测乳头状甲状腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤临近正常组织中IncRNAH19以及IncRNAPTCSC3的表达量：[0055]1细胞总RNA的提取[0056]1取肿瘤组织和肿瘤临近正常组织各50mg，分别用PBSpH为7·4清洗，加入ImlTrizol，移入1.5mlEP管中，混勾，静置5min;[0057]⑵12000γριή，4Γ离心IOmin;[0058]3加入200μ1氯仿，剧烈摇晃15s，静置5min;[0059]⑷12000rpm，4°C离心15min;小心将上层水相移入新的1.5mlEP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放入_20°C下1小时；[0060]512000rpm，4°C离心lOmin，小心弃上清；[0061]6加入Iml的体积浓度为75%乙醇DEPC水配置洗涤沉淀，加入乙醇后，将RNA沉淀弹起漂洗；[0062]712000rpm，4°C离心IOmin，倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀；[0063]⑶室温晾干，用30μ1的DEPC焦碳酸二乙酯水溶解，测浓度。[0064]2去除基因组DNA的反应，使用Superscript111First-StrandSynthesisSystemKit，将步骤1中提取的细胞总RNA配制为表1所示的混合体系，将混合体系在42°C下静置2min，去除RNA中混有的基因组DNA。[0065]表1去除DNA的反应混合体系[0067]3使用PrimeScript_®RTase反转录试剂盒，将冷藏储存的反转录试剂盒取出后，放置恢复至室温20-25Γ，将步骤2中获得的组织总RNA反转录为cDNA，组织总RNA反应液为1〇μ1，反转录的反应程序为:37°C保持15min，85°C保持5s，4°C恒温静置，所述反转录的扩增体系如下所示：[0068]表2反转录扩增体系L〇〇7〇J4构建阳性标准品质粒[0071]1以步骤3中所得的cDNA为模板，采用IncRNAH19的扩增引物IncRNAH19-F和IncRNAH19-R扩增得到IOlbp的目标片段，其中上游引物IncRNAH19-F的序列如SEQIDNO.3所示，下游引物IncRNAH19-R的序列如SEQIDNO.4所示。PCR产物纯化（QIAGEN,German回收目标片段并连接到pMD18-T购自Takara克隆载体，然后转化到DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆提取质粒DNA，得到阳性标准品pMD18-T-lncRNAHl9。[0072]2以步骤3中所得的cDNA为模板，采用IncRNAPTCSC3的扩增引物IncRNAPTCSC3-F和IncRNAPTCSC3-R扩增得到226bp的目标片段，其中上游引物IncRNAPTCSC3-F的序列如SEQIDNO.5所示，下游引物IncRNAPTCSC3-R的序列如SEQIDNO.6所示。PCR产物纯化QIAGEN，German回收目标片段并连接到pMD18-T购自Takara克隆载体，然后转化至ljDH5a感受态细胞，筛选阳性克隆提取质粒DNA，得到阳性标准品pMD18-T-lncRNAPTCSC3。[0073]5反转录反应后，以步骤3中所得的cDNA为模板，选择SYBR.PremixExTaqΠ试剂盒购自Takara进行qPCR操作，检测组织中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达情况，每个样本设置至少3个平行对照组，以GAPDH作为内参，同时设置ddH20阴性对照和阳性标准品对照（pMD18-T-lncRNAH19和pMD18-T-lncRNAPTCSC3;lncRNAH19扩增的上游引物IncRNAH19-F的序列如SEQIDNO.3所示，下游引物IncRNAH19-R的序列如SEQIDNO.4所示。lncRNAPTCSC3扩增的上游引物lncRNAPTCSC3-F的序列如SEQIDN0.5所示，下游引物IncRNAPTCSC3-R的序列如SEQIDNO.6所示；内参GAPDH扩增的上游引物GATOH-F序列为5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’，GAPDH扩增的下游引物GAPDH-R序列为5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’^PCR的反应体系I如下所示，为减少平行复孔间的人为误差，试剂需同时配置每个引物所需的总量再分加至已加入相应cDNA的孔中。每孔的总体积为20μ1，此过程务必在三十分钟内完成：[0074]表3qPCR反应体系I[0077]用微孔板盖盖好板或是用相应的封口膜封住96孔板，离心使得所加试剂均位于孔板底部，孔壁上无残留；荧光定量PCR使用ABI公司开发的实时荧光定量PCR仪进行检测。反应程序为:95°C保持30s，（95°C保持15s，60°C保持30s，40个循环，60°C保持5min。[0078]癌症组织和正常组织中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的检测结果如图1所示，甲状腺淋巴结转移患者中的IncRNAH19表达量高于甲状腺淋巴结转移非转移的患者，而甲状腺淋巴结转移患者中的IncRNAPTCSC3表达量低于甲状腺淋巴结转移非转移的患者，表明IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达水平与甲状腺癌淋巴结转移具有密切的相关性。[0079]实施例2[0080]本实施例提供一种应用检测探针测定样本中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3表达量的方法，具体包括以下步骤：[0081]1构建阳性标准品质粒[0082]应用实施例1中所示的阳性标准品质粒的构建方法，利用引物IncRNAH19-F’和IncRNAH19-R’扩增IncRNAH19片段，连接至pMD18-T，得到阳性标准品质粒pMD18-T-IncRNAH19-2;利用引物IncRNAPTCSC3-F’和IncRNAPTCSC3-R’扩增IncRNAPTCSC3片段，连接至PMD18-T，得到阳性标准品质粒pMD18-T-lncRNAPTCSC3-2。[0083]2以实施例1中所得的cDNA为模板，选择PremixExTaqTM试剂盒购自Takara进行qPCR操作，检测组织中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达情况，每个样本设置至少3个平行对照组，以GAPDH作为内参，同时设置CldH2O阴性对照和阳性标准品对照（pMDlS-T-IncRNAH19-2和pMD18-T-lncRNAPTCSC3-2;IncRNAH19的检测探针IncRNAH19-P的序列如SEQIDN0.11所示，探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA;lncRNAH19扩增的上游引物IncRNAH19-F’的序列如SEQIDNO.7所示，下游引物IncRNAH19-R’的序列如SEQIDNO.8所示。lncRNAPTCSC3的检测探针lncRNAPTCSC3-P的序列如SEQIDN0.12所示，探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA;lncRNAPTCSC3扩增的上游引物IncRNAPTCSC3-F’的序列如SEQIDNO.9所示，下游引物IncRNAPTCSC3-R’的序列如SEQIDNO.10所示；内参GAI3DH的检测探针GAPDH-P序列为5’-GTGCTAAGCAGTTGGTGGTGCAGGA-3’，探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA;GAPDH扩增的上游引物GAPDH-F序列为5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’，GAPDH扩增的下游引物GAPDH-R序列为5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’4PCR的反应体系II如下所示，为减少平行复孔间的人为误差，试剂需同时配置每个引物所需的总量再分加至已加入相应cDNA的孔中。每孔的总体积为20μ1，此过程务必在三十分钟内完成：[0084]表4qPCR反应体系II[0086]用微孔板盖盖好板或是用相应的封口膜封住96孔板，离心使得所加试剂均位于孔板底部，孔壁上无残留；荧光定量PCR使用ABI公司开发的实时荧光定量PCR仪进行检测。反应程序为:95°C保持30s，（95°C保持15s，60°C保持30s，40个循环，60°C保持5min。[0087]癌症组织和正常组织中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的检测结果同实施例1中的检测结果如图2所示：甲状腺淋巴结转移患者中的IncRNAH19表达量高于甲状腺淋巴结转移非转移的患者，而甲状腺淋巴结转移患者中的IncRNAPTCSC3表达量低于甲状腺淋巴结转移非转移的患者，进一步验证了IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达水平与甲状腺癌淋巴结转移具有密切的相关性。[0088]实施例3[0089]本实施例提供一种联合检测样本中的IncRNAH19和IncRNAPTCSC3,以提高样本分类准确性的方法，具体包括以下步骤：[0090]1、用qPCR分别检测出样本中与甲状腺癌淋巴结转移具有密切相关性的IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量。[0091]2、用数学分析方法对步骤1中测得的样本中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达情况进行统计学处理，在此基础上获得具有样本分类意义的分级标准。这样的数学方法优选由计算机完成，本实施例中用这些数据绘制ROC曲线，从而对个体的样本进行分类。[0092]ROC曲线全称为受试者工作特征曲线（receiveroperatorcharacteristiccurve，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。ROC曲线是反映真阳性率灵敏度，又称敏感性，sensitivity和假阳性率1-特异性，specificity连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值阈值或临界值，cut-offvalue，是划分诊断试验结果正常与异常的界值作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积AUC越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。ROC曲线AUC值在1.0和0.5之间。在AUOO.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5〜0.7时有较低准确性，AUC在0.7〜0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。[0093]ROC曲线的评价方法与传统的评价方法不同，根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果分为多个有序分类，比如:正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。[0094]上述有序分类，对于疾病的诊断而言，可分为：阴性、不确定、阳性。进一步地，对于甲状腺癌诊断而言，可分为:转移、不转移。[0095]本实施例中的具体检测步骤如下：[0096]1分别测定样本中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量；[0097]2根据所测得的IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量通过二分类logistic回归计算新的联合检测预测值；[0098]3以联合检测预测值为变量，根据不同的阈值池即联合检测预测值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算曲线下面积AUC;[0099]⑷按照期望的灵敏度和特异性，对测定样本进行分类转移或不转移）。[0100]ROC曲线的绘制可以使用现有技术领域的软件或系统，比如=MedCaIc9.2.0.1医学统计软件、SPSS9·0、R0CP0WER·SAS、DESIGNR0C·F0R、MULTIREADER_P0WER·SAS，CREATE—R0C.SASGBSTATV10.0DynamicMicrosystems，Inc.SilverSpring,MD,USA等等。[0101]本实施例中以IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的表达量所计算的联合检测预测值为变量，使用SPSS软件绘制的ROC曲线并计算曲线下面积AUCJOC曲线如图3所示，联合检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3诊断甲状腺癌淋巴结转移的AUC=O.79，p〈0.01。当阈值为〇.33联合检测预测值时，诊断甲状腺癌淋巴结转移的灵敏度为0.67，特异性为0.89，实际诊断甲状腺癌淋巴结转移的准确性好。将IncRNAH19和IncRNAPTCSC3作为甲状腺癌淋巴结转移的联合诊断标记物，具有特异性强、灵敏度高的优点，应用其检测甲状腺癌淋巴结转移，能够显著提高检测结果的准确性，为甲状腺癌患者的诊断、预后，以及治疗效果的评估提供重要的参考信息，便于提供及时、针对性的治疗，提高患者的存活率和生存质量，因此联合检测H19和PTCSC3具有很大的开发价值。[0102]实施例4[0103]本实施例提供了一种用于癌症诊断的试剂盒，试剂盒包括：[0104]1分别用于检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的引物，具体的为实施例2中所述的用于检测IncRNAH19表达量的上游引物IncRNAH19-F和下游引物IncRNAH19-R，以及检测IncRNAPTCSC3表达量的上游引物IncRNAPTCSC3-F和下游引物IncRNAPTCSC3-R;[0105]上述的试剂盒还包括：[0106]2qPCR反应混合液I，qPCR反应混合液I包括实施例1中表3所示的反应体系；[0107]3IncRNAH19标准品I，实施例1中构建的载体pMD18-T-lncRNAH19或包括上述载体的基因工程菌；[0108]4IncRNAPTCSC3标准品I，实施例1中构建的载体pMD18-T-lncRNAPTCSC3或包括上述载体的基因工程菌；[0109]5内参GAPDH以及内参的检CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’、GAPDH-R:5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’。[0110]本发明提供的试剂盒能够应用于肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3表达量的检测，进一步，由于IncRNAH19和IncRNAPTCSC3作为联合诊断标记物具有检测的灵敏度高和特异性强的优点，本实施例提供的试剂盒能够对测定样本是否为甲状腺癌淋巴结转移进行有效的判定;进而为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌的预后或治疗效果的监测提供可靠的信息。[0111]实施例5[0112]本实施例提供了一种用于癌症诊断的试剂盒，试剂盒包括：[0113]1分别用于检测IncRNAH19和IncRNAPTCSC3的检测探针与扩增引物，具体地为实施例2中提供的检测探针IncRNAH19-P、IncRNAPTCSC3-P、IncRNAH19的扩增引物IncRNAH19-F’和IncRNAH19-R’，以及IncRNAPTCSC3的扩增引物IncRNAPTCSC3-F’和IncRNAPTCSC3-R’；[0114]上述的试剂盒还包括：[0115]2qPCR反应混合液II，qPCR反应混合液II包括实施例2中表4所示的反应体系；[0116]3IncRNAH19标准品II，实施例2中构建的载体pMD18-T-lncRNAH19-2或包括上述载体的基因工程菌；[0117]⑷IncRNAPTCSC3标准品II，实施例2中构建的载体pMD18-T-lncRNAPTCSC3-2或包括上述载体的基因工程菌；[0118]5内参GAPDH以及内参的检测探针GAPDH-P和扩P:5’-GTGCTAAGCAGTTGGTGGTGCAGGA-3’，GAPDH-F:5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’、GAPDH-R:5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’。[0119]本发明提供的试剂盒能够应用于肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体中IncRNAH19和IncRNAPTCSC3表达量的检测，由于IncRNAHl^PlncRNAPTCSC3作为联合诊断标记物具有检测的灵敏度高和特异性强的优点，本实施例提供的试剂盒能够对测定样本是否为甲状腺癌淋巴结转移进行有效的判定;进而为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌的预后或治疗效果的监测提供可靠的信息。[0120]对比例1[0121]使用SPSS软件分别对IncRNAH19和IncRNAPTCSC3测量值为变量，根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算曲线下各自面积AUC;绘制出ROC曲线并计算曲线下面积AUC。如图4所示，IncRNAH19和IncRNAPTCSC3诊断甲状腺癌淋巴结转移的AUC值分别如下：lncRNAH19AUC=0.56;P=0.54和IncRNAPTCSC3AUC=0.61;P=0.27。因此，单独以IncRNAH19或IncRNAPTCSC3作为标记物检测甲状腺癌淋巴结转移，标记物的灵敏度和特异性低，检测的准确性低，易出现假阳性或假阴性的检测结果。因此，IncRNAH19或IncRNAPTCSC3的单独检测无法指示乳头状甲状腺癌淋巴结转移。[0122]对比例2[0123]以MNCR单独测量值为变量，并使用SPSS软件对MNCR和IncRNAPTCSC3测量值进行线性回归处理得到两者联合检测的预测率，再以此预测率为变量，根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算曲线下面积AUC;绘制出ROC曲线并计算曲线下面积AUC，如图5所示，单独检测BANCR和联合检测BANCR和PTCSC3诊断甲状腺癌淋巴结转移的AUC分别为：BANCRAUC=O.60，P=O.28;联合检测BANCR和IncRNAPTCSC3的AUC=0·61，p=0·24。相比联合检测IncRNAHl9和IncRNAPTCSC3，单独检测BANCR和联合检测BANCR和IncRNAPTCSC3均不能有效地指示乳头状甲状腺癌淋巴结转移。[0124]对比例3[0125]使用SPSS软件对BANCR、IncRNAPTCSC3和IncRNAH19测量值进行线性回归处理得到两者联合检测的预测率，以此预测率为变量，根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算曲线下面积AUC;绘制出ROC曲线并计算曲线下面积AUC，如图6所示联合检测MNCRUncRNAPTCSC3和IncRNAH19诊断甲状腺癌淋巴结转移的八1^=0.62，？=0.19。因此，联合检测111^?祖？1^03和111^?祖！119的检测准确性优于联合检测BANCR、IncRNAPTCSC3和IncRNAH19,将IncRNAPTCSC3和IncRNAH19作为诊断甲状腺癌淋巴结转移的联合标记物，有利于甲状腺癌淋巴结转移的诊断、预后，以及甲状腺癌治疗效果的监测。[0126]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

权利要求：1.一种癌症联合诊断标记物，其特征在于，所述癌症联合诊断标记物包括IncRNAHl9和IncRNAPTCSC3。2.根据权利要求1所述的癌症联合诊断标记物，其特征在于:所述IncRNAH19的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述IncRNAPTCSC3的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的癌症联合诊断标记物在制备癌症诊断、癌症预后评估和或癌症治疗监测的试剂中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述癌症为甲状腺癌。5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述癌症诊断为甲状腺癌淋巴结转移诊断。6.—种用于癌症诊断的引物组，其特征在于，所述引物组包括基于权利要求1或2所述的癌症联合诊断标记物设计的引物。7.根据权利要求6所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下所述引物：IncRNAH19-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；IncRNAH19-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；IncRNAPTCSC3-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；IncRNAPTCSC3-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；IncRNAH19-F’，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；IncRNAH19-R’，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；lncRNAPTCSC3-F’，其核苷酸序列如SEQIDN0·9所示；lncRNAPTCSC3-R’，其核苷酸序列如SEQIDN0·10所示。8.—种用于癌症诊断的检测探针组，其特征在于，所述检测探针组包括基于权利要求1或2所述的癌症联合诊断标记物设计的检测探针。9.根据权利要求8所述的检测探针组，其特征在于，所述检测探针组包括如下所述探针：IncRNAH19-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；IncRNAPTCSC3-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。10.根据权利要求9所述的检测探针组，其特征在于，所述检测探针的5’端连接有报告荧光基团，3’端连接有淬灭荧光基团;所述报告荧光基团选自FAM、HEX或Cy5,所述淬灭荧光基团选自TAMRA、BHQ-I、BHQ-2或BHQ-3。11.一种用于癌症诊断的检测芯片，其特征在于，所述检测芯片包括权利要求8-10任一项所述的检测探针。12.—种用于癌症诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6-7任一项所述的引物、权利要求8-10任一项所述的检测探针和或权利要求11所述的检测芯片。13.权利要求12所述的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴提取样本总RNA，将所述总RNA反转录为cDNA;⑵以所述cDNA作为qPCR的模板，应用所述引物、所述检测探针或所述检测芯片，分别检测样本中所述IncRNAH19和所述IncRNAPTCSC3的表达量。

百度查询： 江苏省原子医学研究所 一种癌症联合诊断标记物及其用途

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