申请/专利权人：西南大学

申请日：2019-03-11

公开（公告）日：2020-11-27

公开（公告）号：CN109867716B

主分类号：C07K14/415(20060101)

分类号：C07K14/415(20060101);C12N15/29(20060101);C12N15/82(20060101);A01H5/02(20180101);A01H6/20(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.27#授权;2019.07.05#实质审查的生效;2019.06.11#公开

摘要：本发明提供蜡梅CpVIN3基因及其在花期调控中的应用。本发明提供的蜡梅CpVIN3的基因序列如SEQIDNo.1所示。本发明首次克隆获得蜡梅CpVIN3基因，并通过转基因技术，在植物拟南芥中验证了该基因的功能。通过将CpVIN3基因转入拟南芥，对其表型进行观察来初步验证该基因功能，对比转基因与野生型拟南芥表型发现，在4℃春化处理的条件下，转基因型拟南芥的开花时间比野生型拟南芥提前，莲座叶数量与野生型相比减少，说明该基因在春化作用诱导成花过程中调节植物营养生长向生殖生长的转化。

主权项：1.蜡梅CpVIN3蛋白，其为：由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质。

全文数据：蜡梅CpVIN3基因及其应用技术领域本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅CpVIN3基因的克隆及其应用。背景技术蜡梅ChimonanthuspraecoxL.Link是一种我国特有的冬季开花多年生灌木，因其色如蜜蜡，芳香馥郁而声名远播，傲雪绽放的特性使它成为深受人们喜爱的园林观赏植物，在我国几千年的历史长河中，蜡梅在苗圃和盆景中的栽培和种植别具一格。除此之外，蜡梅是第四纪冰川孑遗植物，在古老的进化系统中占据重要地位[2]。数百年来，人们对蜡梅的研究主要集中在种质资源、品种类别和栽培种植等方面，近年，随着分子生物学的蓬勃发展，人们对蜡梅的认识也逐渐转入分子水平。近年来，对蜡梅基因的分子克隆发展迅速，研究领域集中在抗逆性及开花机制等方面。此外，眭顺照等人利用EST技术构建了第一个蜡梅花的cDNA文库，就此分析蜡梅开花过程中的基因表达，以此为基础先后克隆出蜡梅花发育相关的不同基因，并分析其表达特性：如蜡梅冷适应蛋白基因Cpcor413pm1，使烟草的耐寒性得到了极大提高；蜡梅胰蛋白酶抑制基因CpKTI，使植物抗虫性增强；与植物的极性生长、抗病抗逆性、激素信号传导、活性氧的产生以及细胞的凋亡等密切相关的基因CpRAC1；胚胎发育晚期富积蛋白基因CpLEA基因，主要在种子成熟和发育阶段表达，是一类低分子量蛋白，在花粉粒或植物根叶中干旱、高盐或低温情况下，LEA蛋白表达量显著增加。蜡梅Patatin-like蛋白基因CpPLP植物防御病虫害的一种手段，而且还能提高植物应对干旱胁迫的能力。蜡梅CpEXP1基因的表达与蜡梅花蕾脱落存在一定的相关性。热激蛋白CpHSP70-1和CpHSP70-2基因在正常情况下与应激条件下都能发挥重要的生理功能。基于对上述蜡梅基因功能的初步了解，为蜡梅基因克隆及功能的研究奠定了一定基础。通过对春化作用拟南芥功能缺失突变体的研究，初步揭示了春化作用的分子机制。在拟南芥中已发现6个与春化作用直接相关的基因VIN3、VRN1，VRN2，VRN3，VRN4和VRN5。在VIN3突变体植株中，低温处理并不能影响FLC的表达量，这表明VIN3直接抑制了FLC基因的表达。更重要的是VIN3的诱导需要一定时间的低温处理，直到VIN3被诱导，FLC方能被抑制。VIN3的表达受温度的控制，当温度不足以使VIN3被激活时，FLC也不会被抑制，并且VIN3的表达部位仅仅只在茎尖和根尖，这与FLC的表达位点一致。当VIN3被诱导表达后迅速抑制FLC的表达，而当植株由春化的低温条件转到正常生长环境后，VIN3的诱导迅速关闭。因而VIN3的作用是在春化过程中识别低温，进而抑制FLC的表达。VIN3基因编码一个PHD锌指结构蛋白能够改变染色质的空间结构从而使基因沉默，引起FLC功能钝化，消除其对植物开花的抑制效应。研究发现，春化作用诱导VIN3的表达，VIN3与VRN1和VRN2共同形成春化复合体，作用于FLC染色质组蛋白的H3K9和H3K27使其发生二甲基化和三甲基化修饰，以及H3K9和H3K14的去乙酰化等修饰，引起染色质结构的重塑，使植株表现为早花。而在突变体中，H3K9和H3K14并未发生去乙酰化的变化。VIN3所编码的蛋白本身没有去乙酰化酶的活性。VRN1编码Myb相关的DNA结合蛋白，VRN2编码PRC2蛋白。VRN1和VRN2的表达情况并不受春化作用的影响，在VRN1和VRN2的突变体中，春化处理条件下，由于VIN3的作用，FLC的表达明显降低，但当回暖后，FLC的表达又迅速升高。这表明VRN1和VRN2并不是在春化过程中起作用，而是继VIN3作用后，在植株回到正常温度环境下时，维持对FLC的抑制。蜡梅是我国特有的观赏植物，但其特有的冬季开花机制尚不明确。蜡梅的开花与春化作用密切相关，VIN3基因是影响春化作用的关键基因。在目前的研究中，人们已经全面地了解了拟南芥、甘蓝等模式植物中VIN3的功能和作用机制，但是在蜡梅中CpVIN3的相关报道还未出现，且对其功能及作用有着许多猜想，需进行大量的实验加以证实。发明内容本发明的目的是提供蜡梅CpVIN3基因及其应用。为了实现本发明目的，本发明的蜡梅CpVIN3蛋白，其为：1由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或，2在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1衍生的蛋白质。本发明还提供编码蜡梅CpVIN3蛋白的基因，序列如SEQIDNo.1所示。本发明还提供含有CpVIN3基因的载体、宿主细胞及工程菌。本发明还提供CpVIN3基因在春化作用中促进植物开花的应用。具体地，将所述CpVIN3基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达。本发明还提供CpVIN3基因在制备转基因植物中的应用。本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有CpVIN3基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。本发明具有以下优点：通过分析转录组数据库，首次克隆获得蜡梅春化基因CpVIN3的序列。该cDNA序列全长2045bp，含735bp的最大开放阅读框，编码244个氨基酸的蛋白质，具有PHD锌指蛋白的保守结构域，属于PHD锌指蛋白家族成员，与其他已知植物的VIN3蛋白同源性较高，其中与棕榈科的海枣Phoenixdactylifera相似性最高为63％，系统进化分析显示植物的VIN3蛋白具有较高的种属特异性，各属植物的VIN3蛋白聚在同一支。蜡梅VIN3与海枣亲缘关系最近。通过将CpVIN3基因转入拟南芥，对其表型进行观察来初步验证该基因功能，对比转基因与野生型拟南芥表型发现，在4℃春化处理的条件下，转基因型拟南芥的开花时间比野生型拟南芥提前，莲座叶数量与野生型相比减少，说明该基因在春化作用诱导成花过程中调节植物营养生长向生殖生长的转化。附图说明图1所示为蜡梅CpVIN3基因的克隆。M：DNA分子量标准DL2000；1：ddH2O阴性对照；2：花蕾cDNA模板。图2所示为蜡梅CpVIN3测序结果的BLASTx比对。图3所示为几种不同真核生物VIN3进化树分析。Jc：麻风树JatrophacurcasKDP41489.1；Rc：蓖麻RicinuscommunisEEF48634.1；Me：木薯ManihotesculentaOAY51124.1；Pe：胡杨PopuluseuphraticaXP_011016245.1；Cf：土瓶草CephalotusfollicularisGAV66844.1；Cs：甜橙CitrussinensisXP_006477120.1；Mn：桑树MorusnotabilisEXC52458.1；Nn：莲NelumbonuciferaXP_010254558.1；Vv：葡萄VitisviniferaXP_002283776.2；Nt：烟草NicotianatabacumXP016492646.1；So：菠菜SpinaciaoleraceaKNA15275.1；Pd：海枣PhoenixdactyliferaXP_008805929.1；Eg：油棕ElaeisguineensisXP_010941720.1；Ao：石刁柏AsparaofficinalisXP_020250135.1；Ap：百子莲：Agapanthuspraecoxsubsp.OrientalisAIN76719.1；Atr：无油樟AmborellatrichopodaXP_011623840.1；Sl：番茄SolanumlycopersicumNP_001266153.1；Aa：红掌AnthuriumamnicolaJAT65570.1；Zm：玉米ZeamaysQ7X9V2.1；Ma：芭蕉Musaacuminatasubsp.MalaccensisXP_018682141.1；At：拟南芥ArabidopsisthalianaOAO92506.1；Ta：小麦：TriticumaestivumABM81546.1；Cp：蜡梅Chimonanthuspraecox。图4所示为pCAMBIA1300-CpVIN3的PCR检测及双酶切验证。M：DNA分子量标准DL2000；A1-7：含pCAMBIA1300-CpVIN3表达载体质粒的大肠杆菌DH5α菌液PCR检测；A8：阴性对照ddH20；B1-3：pCAMBIA1300-CpVIN3质粒双酶切。图5所示为pCAMBIA1300-CpVIN3转化农杆菌GV3101的PCR鉴定及双酶切验证。A1-9：农杆菌菌液PCR检测；A10：阳性对照pT-CpVIN3质粒B1-2：农杆菌质粒pCAMBIA1300-CpVIN3反转大肠杆菌DH5α的双酶切鉴定。图6所示为转基因拟南芥的潮霉素抗性筛选。图7所示为转基因拟南芥中CpVIN3基因的PCR检测。M：DNA分子量标准，DL2000；1：野生型拟南芥；2：阳性对照pCAMBIA1300-CpVIN3重组质粒3-6：转基因拟南芥中CpVIN3基因的PCR检测。图8所示为转基因拟南芥中CpVIN3基因的相对表达分析。WT：野生型拟南芥；10-3、2-9、3-9、9-13：转CpVIN3基因拟南芥不同单株系。以拟南芥Actin基因作为内参基因，每次实验设3次技术重复，每一组值为平均数±标准误n＝3。图9所示为转CpVIN3基因拟南芥T2代株系表型观察。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1蜡梅CpVIN3基因的克隆对蜡梅花转录组测序中的CpVIN3基因进行克隆，对获得的序列片段通过NCBIhttp:www.ncbi.nlm.nih.govBLAST程序的BlastNNucleotide-nucleotideBLAST和BlastXTranslatedqueryvs.proteindatabase进行比对分析，获得目标克隆子。根据获得的蜡梅CpVIN3基因cDNA序列，用软件Primerprimer5.0设计1对跨最大ORF框的特异引物进行PCR扩增，引物序列如下：CpVIN3-F：‘5-GCCTCACTCTTCTGTACCCT-3’CpVIN3-R：‘5-TTAGTTGGTTACCCCATCAT-3’分别以蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpVIN3基因，PCR反应体系及反应条件如下：PCR扩增条件为：PCR扩增获得的产物用l％的琼脂糖凝胶进行检测，从蜡梅花cDNA中扩增出大小一致约800bp左右的特异产物图1，并按照天根公司普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒说明书对目的DNA片段进行回收，离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收可能正确的条带。目的片段与克隆载体pMD19-T连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，将获得的阳性克隆菌液送至成都擎科测序部进行测序，序列如SEQIDNo.1所示。在NCBI上将测序结果进行BLASTX比对发现，目标序列与其他物种VIN3基因有较高的相似性。其中，与海枣Phoenixdactylifera，XP_008805929.1VIN3-like蛋白相似性最高为63％，其次为油棕Elaeisguineensis，XP_010941721.1和莲Nelumbonucifera，XP_010254558.1，相似性为62％，其次为芭蕉Musaacuminatasubsp.malaccensis，XP_009414487.161％，与葡萄Vitisvinifera，XP_002283776.2相似性为60％图2。进一步确定获得的序列来源于蜡梅春化基因CpVIN3的cDNA序列，对该基因进行联机比较分析，未发现任何与之同源的已发表的蜡梅基因序列，因此推测该基因是我们首次在蜡梅中分离得到的蜡梅CpVIN3基因，将其命名为CpVIN3。利用DNAstar软件包的EditSeq、ORFFinder和VectorNTI9.0软件对蜡梅CpVIN3基因的cDNA序列特征进行分析，含有1个735bp的完整开放阅读框OpeningReadFrame，ORF，编码区由191个G、123个C、216个A和205个T组成，G+C含量约为42.72％，A+T含量约为57.28％。将CpVIN3编码的蛋白与已有的植物VIN3蛋白家族构建进化树进行系统分类，如图3显示，蜡梅的VIN3蛋白与棕榈科的海枣Phoenixdactylifera，XP_008805929.1亲缘关系最近，与同为棕榈科的油棕Elaeisguineensis，XP_010941720.1和天门冬科的石刁柏Asparaofficinalis，XP_020250135.1及石蒜科的百子莲Agapanthuspraecoxsubsp.Orientalis，AIN76719.1聚为一支。此外，来自荨麻科的麻风树Jatrophacurcas，KDP41489.1，大戟科的蓖麻Ricinuscommunis，EEF48634.1，同为大戟科的木薯Manihotesculenta，OAY51124.1，杨柳科的胡杨Populuseuphratica，XP_011016245.1，芸香科的甜橙Citrussinensis，XP_006477120.1，桑科的桑树Morusnotabilis，EXC52458.1，土瓶草科的土瓶草Cephalotusfollicularis，GAV66844.1，葡萄科的葡萄Vitisvinifera，XP_002283776.2，茄科的烟草Nicotianatabacum，XP016492646.1，藜科的菠菜Spinaciaoleracea，KNA15275.1聚在另一支，与蜡梅CpVIN3蛋白亲缘关系较近。系统进化树的分析结果也暗示了蜡梅CpVIN3基因与其他物种的VIN3基因具有共同的进化起源。实施例2蜡梅CpVIN3基因植物表达载体的构建结合CpVIN3基因ORF框序列自身限制性酶切位点的分布特点及所用植物超表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点特征，设计一对基因特异引物，并分别在引物上下游加入酶切位点KpnI和SalI及相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpVIN3基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点。引物名称及序列如下：p-CpVIN3-F方框部分为KpnI酶切位点，下划线为保护碱基；p-CpVIN3-R方框部分为SalI酶切位点，下划线为保护碱基。以实施例1中克隆获得的菌液为模板，带有KpnI和SalI酶切位点的特异引物进行PCR扩增，回收片段后与pMD19-T克隆载体连接，经PCR鉴定表明，获得与预期结果一致约800bp左右的特异片段。同时将阳性克隆菌液送测序，PCR鉴定和测序结果鉴定均正确后，用KpnI和SalI内切酶对重组质粒pMD19-TCpVIN3和表达载体质粒pCAMBIA-1300分别进行双酶切，回收目的基因的小片段和载体大片段并连接，对结果进行PCR鉴定和双酶切验证，均获得了与预期大小一致的特异片段，如图4所示，进一步测序验证，结果表明蜡梅CpVIN3基因的植物表达载体构建成功，将其命名为pCAMBIA1300-CpVIN3。提取pCAMBIA1300-CpVIN3的质粒转入农杆菌GV3101，对农杆菌菌液进行PCR鉴定和反转大肠杆菌的酶切验证图5，结果表明成功将植物表达载体pCAMBIA1300-CpVIN3质粒转入农杆菌。实施例3CpVIN3转化拟南芥及转记忆拟南芥的表型观察花序侵染法转化拟南芥，将获得的转基因拟南芥T0代种子进行潮霉素抗性筛选，阳性植株在抗性培养基上生长良好，而非转基因植株则在含潮霉素抗性的培养基上植株矮小黄化，如图6所示。提取4个转基因拟南芥株系和野生型拟南芥植株的叶片基因组DNA，用CpVIN3基因的特异引物进行PCR鉴定。结果表明图7，所得的转基因拟南芥株系均能扩增出与阳性对照大小一致的目的条带，而野生型拟南芥未扩增出目的条带，表明目的基因CpVIN3已成功插入到拟南芥基因组中。为进一步验证CpVIN3基因在转基因拟南芥中的表达情况，提取转基因拟南芥和野生型拟南芥植株的总RNA，以反转录后的cDNA第一链为模板，拟南芥Actin基因作为内参基因，对转基因拟南芥中CpVIN3基因的相对表达情况进行检测和分析。转基因植株荧光定量PCR所用引物如表1所示。表1转基因植株荧光定量PCR所用引物荧光定量PCR结果如图8所示。野生型拟南芥中未检测到CpVIN3基因的表达，在检测的4个转基因拟南芥株系中，CpVIN3基因的表达差异较大，其中10-3号株系的表达量最高，其余株系的表达量较低，最高表达的10-3号株系表达量是最低表达的9-13号单株系的10倍左右。在后期对转基因拟南芥进行分析时，根据实时荧光定量结果，选取表达量最高的10-3号株系、表达量中等的3-9号和表达量稍低的2-9号株系代表转基因不同表达量的株系进行表型观察和相关处理。对T2代转基因拟南芥株系和野生型拟南芥对照进行表型观察及相关指标测定。播种十天后，将CpVIN32-9、CpVIN33-9、CpVIN310-3株系和野生型WT拟南芥进行单株移栽，开始进行4℃春化处理，如图9所示，转基因拟南芥株系的现蕾时间、抽薹时间、第一朵花和第一个果荚出现时间都比野生型拟南芥植株早，在生长30天后即春化处理20天后，转基因拟南芥株系CpVIN310-3、CpVIN32-9和CpVIN33-9的节间长度分别为野生型植株的2.91倍、1.66倍和1.13倍。说明4℃处理CpVIN3基因的表达对拟南芥的生长发育过程有一定促进作用。转基因拟南芥的三个株系与野生型拟南芥相比莲座叶的数量均比野生型的减少，其中CpVIN32-9、CpVIN33-9与WT之间有差异莲座叶平均数为10.25、10.42和12.17片，而CpVIN310-3莲座叶平均数为8.92片与WT相比具有显著差异表2，现蕾时间CpVIN33-9与WT之间无显著差异，CpVIN32-9与WT相比有差异但差异不明显，而CpVIN310-3与WT相比具有显著差异、开花提前。抽薹时间几个株系之间差异更为明显，其中CpVIN310-3与WT之间有极显著差异，CpVIN33-9和野生型相比则具有显著差异，CpVIN32-9相对来说差异不甚明显。第一朵花开的时间CpVIN310-3，CpVIN32-9和CpVIN33-9与WT相比的趋势抽薹情况一致；第一个果荚的时间CpVIN310-3与WT相比具有显著差异，CpVIN32-9和CpVIN33-9则有差异。上述结果表明，拟南芥过表达CpVIN3株系CpVIN32-9、CpVIN33-9和CpVIN310-3莲座叶数目及CpVIN3的相对表达量与拟南芥早花表型较为一致，即CpVIN3高表达的株系CpVIN310-3莲座叶数目明显少于CpVIN32-9、CpVIN33-9与WT，开花提前。由以上的结果可以推测出CpVIN3基因在春化作用中具有促进植物开花的功能。表2T2代转CpVIN3基因拟南芥株系相关指标观察每组数为平均值±标准差；a、b、c、d表示p西南大学蜡梅CpVIN3基因及其应用10SIPOSequenceListing1.01837DNA蜡梅Chimonanthuspraecox1gcctcactcttctgtaccctgaagttctagataagggtcccttttcatttgacctctttc60tacctctctctctctctcgctctctcccagtgttatgagaaatccaggggtgggatttcg120tccgggcatggattccatattttcaggctttgtcctcgatcctgctaaatgtagtgagct180gaacttggaagagaagcgagaattggtgtatgaaatttcacagtggccaaaagacgcccc240tgaaattcttcaatcttggagtcgtcgagaattgctcgaggtcatctgtgcagaaatggg300caaggagaggaaatacactgggattaaaaaactcaacttgatagagcatttactcaggtt360aatagccgagaagaaatcagcaaagaatgccgatcatgccccttctttatcacctacctc420atttacaaaatcccaaaatgtgtttaaaaagcaaaagaagaatgacgatacagtgtgctc480aatcactgacttggggcatttttcgttgaagaaggaagaaggggagcaaaaagatgtctt540gctttgtcaaaatcttgcttgtagagccactttgagccaaggagatgtgttttgtaagag600gtgttcttgctgtatatgttatcgttatgacgacaacaaggatcctagtttatggttggt660ttgtggttctgatggtcctgagcgagatgactcttgtggtttgacgtgccacctgaaatg720tgttctgcagccagaaaaggctggcaatgcaaagagtaggtgccacacaatgttggatgg780aagtttctattgttcttcatgtggtaaagagaatggaatgatggggtaaccaactaa8372244PRT蜡梅Chimonanthuspraecox2MetArgAsnProGlyValGlyPheArgProGlyMetAspSerIlePhe151015SerGlyPheValLeuAspProAlaLysCysSerGluLeuAsnLeuGlu202530GluLysArgGluLeuValTyrGluIleSerGlnTrpProLysAspAla354045ProGluIleLeuGlnSerTrpSerArgArgGluLeuLeuGluValIle505560CysAlaGluMetGlyLysGluArgLysTyrThrGlyIleLysLysLeu65707580AsnLeuIleGluHisLeuLeuArgLeuIleAlaGluLysLysSerAla859095LysAsnAlaAspHisAlaProSerLeuSerProThrSerPheThrLys100105110SerGlnAsnValPheLysLysGlnLysLysAsnAspAspThrValCys115120125SerIleThrAspLeuGlyHisPheSerLeuLysLysGluGluGlyGlu130135140GlnLysAspValLeuLeuCysGlnAsnLeuAlaCysArgAlaThrLeu145150155160SerGlnGlyAspValPheCysLysArgCysSerCysCysIleCysTyr165170175ArgTyrAspAspAsnLysAspProSerLeuTrpLeuValCysGlySer180185190AspGlyProGluArgAspAspSerCysGlyLeuThrCysHisLeuLys195200205CysValLeuGlnProGluLysAlaGlyAsnAlaLysSerArgCysHis210215220ThrMetLeuAspGlySerPheTyrCysSerSerCysGlyLysGluAsn225230235240GlyMetMetGly320DNA蜡梅Chimonanthuspraecox3gcctcactcttctgtaccct20420DNA蜡梅Chimonanthuspraecox4ttagttggttaccccatcat20528DNA蜡梅Chimonanthuspraecox5ggggtaccgcctcactcttctgtaccct28630DNA蜡梅Chimona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权利要求：1.蜡梅CpVIN3蛋白，其为：1由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质2在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的蜡梅CpVIN3蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQIDNo.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7.权利要求2或3所述基因在春化作用中促进植物开花的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达。9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

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