申请/专利权人：中国矿业大学(北京);北京合生元生态环境工程技术有限公司

申请日：2019-06-12

公开（公告）日：2021-01-15

公开（公告）号：CN110243478B

主分类号：C07K14/37(20060101)

分类号：C07K14/37(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.15#授权;2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.17#公开

摘要：本发明公开了一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法。该方法依次包括如下步骤：1播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；2培养，由热红外成像仪测定植物出苗后30‑50d的冠层温度，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量；植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好。实验证明，采用本发明提供的方法可以获取微生物施加剂量。本发明具有重要的应用价值。

主权项：1.一种获取微生物施加剂量的方法，包括如下步骤：1播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；2完成步骤1后，培养，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量；所述“根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量”的判定原则为植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好；所述促进植物生长表现为生物量增加；生物量为根干重、茎干重和叶干重中的至少一种；所述“植物的冠层温度”为植物出苗后35d的冠层温度；所述植物为玉米；所述微生物为链格孢Alternariasp.001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17463。

全文数据：一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法技术领域本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法。背景技术深色有隔内生真菌darkseptateendophytes，DSE是植物内生真菌的主要类群，其主要特征是菌丝颜色较深，具有明显隔膜，定植于健康植物根系的表皮、皮层甚至纤维管束组织的细胞或细胞间隙，形成共生体，而不引起植物病变。DSE可以在高山、极地、低pH土壤等逆境和极端环境中生存。据统计，DSE宿主范围涵盖114科320属的近600种植物，在菌根植物和莎草科、十字花科、藜科等传统非菌根植物的根中均发现DSE定植。DSE能促进植物生长，提高宿主植物的抗逆性和抗病性。DSE能增加宿主植物的光合效果，促进植物根系发育，从而提高植物对土壤中水分的利用率，根系可以将更多的水分运输到植物地上部分，保持水势平衡。DSE真菌的研究主要集中在真菌与植物菌苗的培养方法以及真菌对宿主植物的促生、抗逆效应研究。热红外成像仪是通过非接触方式探测物体的红外能量，并将其转换为电信号，进而在显示器上生成热图像，并可以对热图像进行处理的一种电子检测设备。热红外成像技术是利用热红外成像仪监测物体热反应特征的一种技术。近些年，热红外成像技术在精准农业中应用较多，可有效指导生产实践。植物气孔开闭和应激产生的化学物质对植物温度的影响较大，这也是应用热红外监测植物温度的前提条件。其中，农作物在生长过程中受环境和气候的影响较大，在农产品的质量和产量上间接反应出来，运用热红外技术可以快速准确的测定农作物表面温度变化和热反应特征，并同步监测环境因子，实时监测农作物的生长状况，以探索环境因子对农作物生长生理指标的影响，对作物的生理状况，是否受到干旱、高温、盐碱、寒潮、病虫害等非生物或生物胁迫做出判断和预警。发明内容本发明的目的是获取具有促进植物生长功能的微生物如链格孢Alternariasp.001CGMCCNo.17463的施加剂量。本发明首先保护一种获取微生物施加剂量的方法，可包括如下步骤：1播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；2完成步骤1后，培养，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量。上述方法中，所述微生物具有促进植物生长的功能。上述方法中，所述植物种子可为植物出芽种子。本发明还保护一种筛选具有促进植物生长功能的目的微生物的方法，可包括如下步骤：a1取植物，用待测微生物处理；a2完成步骤a1后，培养，根据植物的冠层温度筛选目的微生物。上述任一所述的方法中，所述“根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量”或所述“根据植物的冠层温度筛选目的微生物”的判定原则可为植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好。上述任一所述植物可为如下c1至c5中的任一种：c1双子叶植物；c2单子叶植物；c3禾本科植物；c4玉米；c5玉米品种中糯一号。上述任一所述的方法中，所述微生物可为真菌。所述真菌可为链格孢Alternariasp.真菌。上文中，当植物为玉米品种中糯一号时，每株玉米施加的链格孢Alternariasp.真菌的最佳剂量可为124.4mg链格孢Alternariasp.真菌的干物质。所述链格孢Alternariasp.真菌具体可为链格孢Alternariasp.001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17463。上述任一所述“植物的冠层温度”可为植物出苗后30-50d的冠层温度。当植物为玉米品种中糯一号时，可为出苗后30-50d如30-35d、35-45d、45-50d、30d、35d、45d或50d的冠层温度。上述任一所述冠层温度可由热红外成像仪采集图像后测定。本发明还保护上述任一所述的方法的应用，可为b1至b3中的至少一种：b1植物生产；b2植物种植；b3调节植物生长。本发明还保护植物的冠层温度的应用，可为d1或d2：d1获取微生物施加剂量；d2筛选目的微生物。上文中，促进植物生长可表现为生物量增加。所述生物量可为根干重、茎干重和叶干重中的至少一种。生物量属于玉米成熟期获得的指标。本发明通过热红外成像仪检测玉米出苗后30-50d如玉米出苗后第35d、玉米出苗后第45d的冠层温度，从而评价菌剂促进植物生长的效果，即获得菌剂的最佳施加剂量。玉米出苗后30-50d的冠层温度越低，则该菌剂促进植物生长的效果越好，该菌剂的施用剂量最佳。采用本发明提供的方法可以获取链格孢Alternariasp.001CGMCCNo.17463的最佳施加剂量。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为玉米出苗后第22d的玉米热红外图像。图2为用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时选择的感兴趣区域。图3为用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时获得冠层温度。图4为各组玉米出苗后第22d、第35d和第57d的冠层温度的统计结果。保藏说明菌种名称：链格孢拉丁名：Alternariasp.菌株编号：001保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2019年04月08日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.17463具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。玉米品种中糯一号以下简称中糯一号的种子为北京中农作科技发展有限公司的产品，认证号为0103006-2000。PDA固体培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1.0L蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向滤液中加入葡萄糖20.0g、KH2PO43.0g、MgSO4.7H2O1.5g、维生素B110μg和琼脂15.0g，调节pH值至6.0并用蒸馏水定容至1.0L，然后115℃灭菌15min。PDA抗性平板：向冷却至55℃的PDA固体培养基中加入氨苄青霉素和硫酸链霉素，得到PDA抗性培养基；PDA抗性培养基中，氨苄青霉素和硫酸链霉素的浓度均为50mgL；将PDA抗性培养基倒入无菌培养皿直径为9cm，自然冷却，得到PDA抗性平板。MMN液体培养基：向适量蒸馏水中加入CaCl20.05g、MgSO40.15g、NaCl0.025g、FeCl30.01g、KH2PO40.5g、VitamibB10.0001g、NH42HPO40.25g、Glucose10g、Citricacid0.2g和Maltextract10g，调节pH值至5.5并用蒸馏水定容至1.0L，然后121℃灭菌30min。下述实施例中的热红外成像仪为菲力尔公司的产品，型号为FLIRT630sc。热红外成像仪的主要参数见表1。表1.热红外成像仪的主要参数下述实施例中热红外成像仪采集玉米热红外图像的步骤参考说明书，具体如下：①打开热红外成像仪，待仪器稳定后即热红外成像仪进入工作模式；②记录热红外成像仪工作环境的温度和湿度信息；③在热红外成像仪内设置辐射率、环境温度和湿度信息便于校正热图信息；④使热红外成像仪的镜头对准玉米冠层，适当调节镜头与玉米冠层之间的距离，使用手动调焦或自动调焦功能，使得玉米冠层图像清晰，按下拍摄键；⑤下一个玉米冠层热红外图像获取重复③-④步骤。⑥拍摄完成后将热图数据导出到电脑端，在热红外专业数据处理软件如FLIRResearchIRMax软件中进行图像处理与分析。下述实施例中FLIRResearchIRMax软件处理玉米热红外图像，得到冠层温度的步骤具体如下：①在FLIRResearchIRMax软件中打开拍摄的玉米热红外图像；②用矩形框选择感兴趣区域，考虑到玉米叶片弯曲和叶尖部位有枯萎的现象，感兴趣区域选择玉米顶端的两片叶子各自的中间三分之一的部位，拍摄所得的玉米叶片在图像中不一定水平，旋转矩形框使得矩形框框选在叶片中间三分之一处；③通过添加函数计算每个感兴趣区域的平均温度，再对感兴趣区域的平均温度取平均值作为该株玉米的冠层温度。实施例1、链格孢Alternariasp.001CGMCCNo.17463的分离、鉴定和保藏一、分离1、用无菌水充分清洗根部样品采自内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系，然后用75％vv乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗2次。2、完成步骤1后，将所述根部样品置于10％vv次氯酸钠水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次。3、完成步骤2后，用滤纸吸去所述根部样品表面的水分，然后剪成长为1cm左右的根段。4、完成步骤3后，将所述根段置于PDA抗性平板每个平板上放置2-3个根段，28℃黑暗培养14d。将在PDA抗性平板上可以生长的菌落进行分离培养并纯化。将筛选到的真菌命名为深色有隔内生真菌001。二、鉴定1、形态学鉴定将深色有隔内生真菌001接种至PDA抗性平板，28℃黑暗倒置培养14d，观察菌落特征；然后进行插片培养，观察菌丝体及产孢情况。菌落的生长状态见图1。结果表明，菌落正面颜色为黑灰色，背面无裂痕，中央平整，边缘圆整，同心圆。菌丝体及产孢情况如下：菌丝深灰色，局部膨大，隔间距5-25μm，厚垣孢子，聚合球形。2、分子鉴定1采用真菌基因组DNA提取试剂盒AXYGEN公司的产品提取深色有隔内生真菌001的基因组DNA并以其作为模板，采用ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应体系为50μL，由5μL10×ExTaqbuffer北京索莱宝科技有限公司的产品、2μLITS1水溶液浓度为10μmolL、2μLITS4浓度为10μmolL、2μL模板、4μLdNTPMix浓度为2.5mM和35μLddH2O组成。反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，28个循环。2将步骤1得到的PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，步骤1得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列1所示的DNA分子。将序列表中序列1所示的核苷酸序列提交到GenBank数据库进行Blast分析，确定其分类地位。然后用MEGA6构建系统发育树，用于亲缘关系和系统发育分析。结果表明，深色有隔内生真菌001与链格孢Alternariasp.的同源性最高。因此，深色有隔内生真菌001被鉴定为链格孢Alternariasp.。三、保藏步骤一分离的深色有隔内生真菌001已于2019年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17463。深色有隔内生真菌001的全称为链格孢Alternariasp.001CGMCCNo.17463，简称为DSE菌株。实施例2、菌剂的制备一、DSE培养菌液的制备1、将DSE菌株接种至PDA固体培养基，28℃黑暗倒置培养14d，得到DSE菌落。2、完成步骤1后，无菌条件下在DSE菌落上取一个菌饼，然后置于MMN液体培养基，28℃、170rmin震荡培养15d，得到DSE培养菌液。1mLDSE培养菌液中DSE菌株干物质质量为3.11mg。二、菌剂的制备制备菌剂1、菌剂2和菌剂3。菌剂1由10mLDSE培养菌液和40mLMMN液体培养基混合而成。菌剂1中，DSE菌株的干物质质量为31.1mg。菌剂2由20mLDSE培养菌液和30mLMMN液体培养基混合而成。菌剂2中，DSE菌株的干物质质量为62.2mg。菌剂3由40mLDSE培养菌液和10mLMMN液体培养基混合而成。菌剂3中，DSE菌株的干物质质量为124.4mg。实施例3、实施例2制备的菌剂对玉米冠层温度的影响一、玉米芽的制备取中糯一号的种子，先用75％vv乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次；然后用10％mv次氯酸钠水溶液浸泡消毒10min，无菌水冲洗3次；最后置于铺有湿润的无菌滤纸的培养皿中，25℃黑暗培养3d，挑选长势一致的玉米芽备用。二、DSE灭活菌液的制备取实施例2步骤一中2制备的DSE培养菌液，121℃灭菌30min，得到DSE灭活菌液。三、实施例2制备的菌剂对玉米冠层温度的影响1、将粘土和沙土分别粉碎后，过筛目数为2mm，然后121℃灭菌2h，自然风干，依次得到风干粘土和风干沙土。2、完成步骤1后，将风干粘土和风干沙土按照质量比为1:1充分混匀，得到混合土壤。3、完成步骤2后，取16个塑料盆塑料盆的规格均为外口径23.5cm，内口径20cm，高度21.5cm，底直径15cm，先用75％vv乙醇水溶液擦拭，然后用无菌水清洗数遍，晾干后装入5kg混合土壤，同时浇水至土壤最大持水量的70％，48h后加入NH4NO3、KH2PO4和KNO3晶体作为底肥，混匀，使土壤中N、P、K的质量分数分别为100mgkg、25mgkg和150mgkg。4、完成步骤3后，将16个塑料盆随机分成对照组、试验组1、试验组2和试验组3四组，每组4个塑料盆，进行如下实验：对照组即CK：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mLDSE灭活菌液；试验组1即DSE20％：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂1；试验组2即DSE40％：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂2；试验组3即DSE80％：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂3。5、完成步骤4后，定量浇水并使土壤湿度约为土壤最大持水量的70％。出苗后每盆定苗为1株。分别在玉米出苗后第22d、第35d和第57d，用热红外成像仪采集采集的时刻为12:00玉米热红外图像，然后用FLIRResearchIRMax软件热红外成像仪自带处理，得到各株玉米的冠层温度；最后按组计算平均值，即获得各组玉米的冠层温度。待玉米出苗60d后收获，将根、茎、叶分离，分别测定干重80℃烘干48h，按组计算平均值。玉米出苗后第22d的玉米热红外图像见图1。用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时选择的感兴趣区域见图2。用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时获得冠层温度见图3。各组玉米出苗后第22d、第35d和第57d的冠层温度统计结果见表2和图4。表2注：同列不同小写字母表示差异显著P中国矿业大学（北京）北京合生元生态环境工程技术有限公司一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法1PatentInversion3.51608DNA链格孢（Alternariasp.）1cccttccgtagggtgaacctgcggagggatcattacacaatatgaaagcgggctggatac60tctgtagtagtggattgctttacggcgtgcgctgctggagagcctagccttgctgaatta120ttcacccgtgtcttttgcgtacttcttgtttccttggtgggctcgcccgccacaaggaca180actcataaaccttttgtaatagcaatcagcgtcagtaacaacataataattacaactttc240aacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtagtg300tgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtatt360ccaaagggcatgcctgttcgagcgtcatttgtaccctcaagctttgcttggtgttgggcg420tcttgtctccagtccgctggagactcgccttaaagtcattggcagccggcctactggttt480cggagcgcagcacaagtcgcactcttttccagccaaggtcagcgtccaacaagccttttt540tcaacttttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcg600gaggaaaa608

权利要求：1.一种获取微生物施加剂量的方法，包括如下步骤：1播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；2完成步骤1后，培养，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量。2.一种筛选具有促进植物生长功能的目的微生物的方法，包括如下步骤：a1取植物，用待测微生物处理；a2完成步骤a1后，培养，根据植物的冠层温度筛选目的微生物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量”或所述“根据植物的冠层温度筛选目的微生物”的判定原则为植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好。4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下c1至c5中的任一种：c1双子叶植物；c2单子叶植物；c3禾本科植物；c4玉米；c5玉米品种中糯一号。5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述“植物的冠层温度”为植物出苗后30-50d的冠层温度。6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述微生物为真菌。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述真菌为链格孢Alternariasp.真菌。8.如权利要求1、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于：当植物为玉米品种中糯一号时，每株玉米施加的链格孢Alternariasp.真菌的最佳剂量为124.4mg链格孢Alternariasp.真菌的干物质。9.权利要求1、3、4、5、6、7或8任一所述的方法的应用，为b1至b3中的至少一种：b1植物生产；b2植物种植；b3调节植物生长。10.植物的冠层温度的应用，为d1或d2：d1获取微生物施加剂量；d2筛选目的微生物。

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