申请/专利权人：安徽微分基因科技有限公司

申请日：2020-06-23

公开（公告）日：2021-05-18

公开（公告）号：CN111808933B

主分类号：C12Q1/6869(20180101)

分类号：C12Q1/6869(20180101);C12Q1/686(20180101);C12N15/10(20060101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.18#授权;2020.11.10#实质审查的生效;2020.10.23#公开

摘要：本发明涉及分子生物学技术二代测序技术领域，且公开了一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：S1、引物设计；S2、PCR扩增；S3、文库质控；S4、上机测序；通过使用自行设计的扩增引用，用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix‑i5‑i7标准品文库。原illumina的Phix文库由于没有index标签，无法进行数据拆分质控，仅能用于平衡测序文库池碱基分布，保证高质量测序数据。本发明中Phix‑i5‑i7标准品文库保留了原本Phix文库测序区段碱基序列，依然可用于平衡测序混池碱基分布，保证高质量测序数据；同时可通过i5‑i7双端index标签对Phix文库进行数据拆分质控，通过Phix文库下机质控数据评估本次测序过程中仪器、试剂是否存在异常因素。

主权项：1.一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于，标准品由以下步骤制备：S1、引物设计：Primer-F：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；Primer-R：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCAS2、PCR扩增：用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix-i5-i7标准品文库；1、PCR扩增体系：使用DNA聚合酶TaqDNAPolymerase进行PCR扩增，扩增体系如下：10×TaqBuffer为5μl、dNTPMix10mMeach为1μl、10μMPrimer-F为2μl、10μMPrimer-R为2μl、5UμlTaqDNAPolymerase为0.5μl、10ngulTemplateDNA为1μl、Nuclease-freeWaterTo50μl；2、PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸45sec，共15个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；3、产物纯化：①、纯化前将磁珠液提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温；②、旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取40μl磁珠液加入50μlDNA扩增产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；③、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，5min，小心移除上清；④、保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；⑤、再次加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；⑥、保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠5-10min；⑦、将样品从磁力架上取出，加入50μlNuclease-freeWater，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；⑧、在磁力架上静置5min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中，做好标记待用S3、文库质控。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 安徽微分基因科技有限公司 一种用于illumina二代测序平台的标准品

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