申请/专利权人：广东省生态环境技术研究所

申请日：2018-10-12

公开（公告）日：2021-06-29

公开（公告）号：CN109207615B

主分类号：C12Q1/689(20180101)

分类号：C12Q1/689(20180101);C12Q1/14(20060101);C12R1/445(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.29#授权;2019.02.12#实质审查的生效;2019.01.15#公开

摘要：本发明公开了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒，属于分析检测领域。本发明是以发夹探针HP结合核酸外切酶ExoIII辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G‑quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。

主权项：1.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于：包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII；其中发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因；其中发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA；发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT；发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT；发夹探针HP的序列如下所示：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCATAGCGTCATTGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCCTATGATCCCAAT-3'。

全文数据：一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒技术领域本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒。背景技术金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus是造成人和动物感染的最主要致病菌，普遍存在于环境和食品中。即使在低浓度下，金黄色葡萄球菌也可危及人与动物的生命健康，比如会引起急性肺炎、败血症、中毒性休克等疾病。目前，常规的金黄色葡萄球菌检测方法主要有微阵列，聚合酶链式反应，高通量测序和表面等离子共振等方法。这些方法需要对待测样品进行分离富集，操作繁琐和费时，不利于快速现场检测。近年来，利用生物传感器检测致病菌的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于金黄色葡萄球菌的检测，使检测过程具有快速、简单、免标记和灵敏度高等特点，从而降低成本，易于推广。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹探针HP和核酸外切酶ExoIII辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法及检测试剂盒。本发明所采取的技术方案是：一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IXNMM和核酸外切酶ExoIII，其中发夹探针HP既包含识别原件又包含信号报告原件。发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同，形成mecA基因类似物，而G-quadruplex序列充当信号报告因子；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。本发明试剂盒中添加了ExoIII，为了防止发夹探针HP被酶切，所以需要在发夹探针HP的3'端连接数个保护性碱基，使其形成3'端突出末端，即IV区。IV区序列与mecA基因的部分序列互补配对。优选的，发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。优选的，发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCASEQIDNO：1。优选的，发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCATSEQIDNO：2。优选的，I与III区序列完全互补。将G-quadruplex紧紧绑住，降低背景信号。优选的，发夹探针HP的III区序列为：TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCSEQIDNO：3。优选的，发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAATSEQIDNO：4。优选的，发夹探针HP的序列如下所示：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCAI区-TAGCGTCATII区-TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCIII区-CTATGATCCCAATIV区-3'SEQIDNO：5。优选的，缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。优选的，缓冲溶液为20mMTris-HCl缓冲溶液，其中含有100mMNaCl，10mMMgCl2，15mMKCl，pH＝7.4。此处，缓冲溶液是模拟生理条件，有利于碱基配对。缓冲液的成分、种类和pH可以适应性调整。优选的，缓冲溶液还包括1×NEBuffer缓冲液，作为ExoIII酶切缓冲液。本发明的反应原理如下：当存在mecA基因时，发夹探针IV区与mecA基因通过碱基互补结合，使发夹探针HP的3’端IV区形成双链DNA的平末端。接着ExoIII从发夹探针HP的3’端逐渐酶切双链DNA，最后切至II区，释放出含有G-quadruplex、mecA基因类似物I和II区和mecA基因。随后mecA基因类似物的I和II区同样与发夹探针HP的IV区结合引发类似mecA基因的反应过程。最后，在mecA基因和mecA基因类似物的不断循环下，释放出大量的G-quadruplex。不断产生的G-quadruplex与荧光染料NMM结合λex＝399nm，λem＝610nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值，产生明显的荧光变化。根据释放的G-quadruplexNMM复合物浓度与荧光强度成线性关系λex＝399nm，λem＝610nm，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecAgene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecAgene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。在最佳条件下，该方法的线性范围从10fM到10nM，检测限为2.4fM。该方法还对其他可能的干扰核酸表现出显著的选择性。牛奶实际样品分析金黄色葡萄球菌mecA基因的结果表明，该方法具有较好的精密度和准确度。一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：1将发夹探针HP溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；2将待测溶液加入到含有发夹探针HP和ExoIII的缓冲溶液，室温下反应；再加入N-甲基卟啉二丙酸IX荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；根据释放的G-quadruplexNMM复合物浓度与荧光强度成线性关系λex＝399nm，λem＝610nm，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。其中，发夹探针HP、缓冲体系、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII如上述任一项所述。当mecA基因不存在时，体系的荧光强度没有变化；当有mecA基因存在时，体系中发夹探针HP与mecA基因结合导致该复合物被ExoIII酶切。在酶切的作用下，发夹探针HP释放出mecA基因和mecA基因类似物。释放的mecA基因和mecA基因类似物不断与发夹探针HP结合，持续释放出G-quadruplex。根据释放的G-quadruplexNMM复合物浓度与荧光强度成线性关系λex＝399nm,λem＝610nm，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecAgene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecAgene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。本发明的有益效果是：本发明是以发夹探针HP结合核酸外切酶ExoIII辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G-quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。附图说明图1为本发明所述的检测方法的原理图；图2为对不同浓度的金黄色葡萄球菌mecA基因检测的结果图；图3为特异性实验结果图。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不局限于此。实施例1一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括下列成分：1发夹探针HP，序列如下：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCAI区-TAGCGTCATII区-TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCIII区-CTATGATCCCAATIV区-3'SEQIDNO：5；2ExoIII及1×NEBuffer缓冲液；320mMTris-HCl缓冲溶液，其中含有100mMNaCl，10mMMgCl2，15mMKCl，pH＝7.4。一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法按照如下步骤进行：1发夹探针HP的形成。将浓度为10μM的发夹探针HP，置于90℃水浴锅中加热10分钟，随后缓慢冷却至室温；2金黄色葡萄球菌mecA基因的检测。首先将2μL待测溶液加入到含有300nM发夹探针HP和37.5UExoIII的38μLTris-HCl缓冲溶液，室温下反应30分钟；再加入500nMNMM荧光染料，室温下接着反应30分钟；最后把反应体系稀释到200μL本实验室荧光仪器所要求，本领域技术人员可以适应性调整。根据释放的G-quadruplexNMM复合物浓度与荧光强度成线性关系λex＝399nm，λem＝610nm，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecAgene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecAgene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。实施例2对不同浓度金黄色葡萄球菌mecA基因的检测：配制金黄色葡萄球菌mecA基因标准溶液，浓度分别为0、10fM、102fM、103fM、104fM、105fM、106fM、107fM、108fM和109fM，4℃保存。将不同浓度的mecA基因溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光强度变化，结果如图2图2A：在λex＝399nm条件下，不同mecA基因浓度所对应的发射光波谱图；图2B：在λex＝399nm条件下，λem＝610nm得到的荧光标准曲线图；所示，10fM的mecA基因可产生明显的荧光变化，说明其检测限10fM。随着mecA基因浓度增加，荧光强度也增加，并逐渐趋于饱和。实施例3特异性实验：配制10nM不同核酸的标准溶液，它们分别是M1，M2，M3和NC。M1:5’-ATTGGGATGATAGCGTCATT-3’SEQIDNO：6，M2:5’-ATTGGGATGATACCGTCATT-3’SEQIDNO：7；M3:5’-ATTGCGATGATACCGTCATT-3’SEQIDNO：8；NC:5’-TGCCGCTCATCCGCCACATA-3’SEQIDNO：9。其中下划线字母代表错配碱基。将10nM的不同干扰物标准溶液和10nMmecA基因溶液分别加入到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光变化，结果如图3所示，10nM的M1、M2、M3和NC荧光强度均远远低于10nM的mecA基因，其中M1体系和M2的荧光强度分别为mecA基因的32％和1％。M3体系和NC的荧光强度与空白组一样。这证明该方法对mecA基因的检测具有较好的特异性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING110广东省生态环境技术研究所120一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒1301609170PatentInversion3.5210121127212DNA213人工序列4001gggtagggcgggttgggattgggatca2721022119212DNA213人工序列4002tagcgtcat9210321127212DNA213人工序列4003tgatcccaatcccaacccgccctaccc27210421113212DNA213人工序列4004ctatgatcccaat13210521176212DNA213人工序列4005gggtagggcgggttgggattgggatcatagcgtcattgatcccaatcccaacccgcccta60cccctatgatcccaat76210621120212DNA213人工序列4006attgggatgatagcgtcatt20210721120212DNA213人工序列4007attgggatgataccgtcatt20210821120212DNA213人工序列4008attgcgatgataccgtcatt20210921120212DNA213人工序列4009tgccgctcatccgccacata20

权利要求：1.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于：包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII；其中发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT。5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT。6.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的序列如下所示：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCATAGCGTCATTGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCCCTATGATCCCAAT-3'。7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。8.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：1将发夹探针HP溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；2将待测溶液加入到含有发夹探针HP和ExoIII的缓冲溶液，室温下反应；再加入N-甲基卟啉二丙酸IX荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；其中，发夹探针HP、缓冲体系、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII如权利要求1-7任一项所述。

百度查询： 广东省生态环境技术研究所 一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD