申请/专利权人：复旦大学

申请日：2021-03-22

公开（公告）日：2021-07-16

公开（公告）号：CN113129996A

主分类号：G16B5/00(20190101)

分类号：G16B5/00(20190101);G16B35/00(20190101);G16B50/00(20190101);G16C10/00(20190101);C12N15/115(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.04.12#授权;2021.08.03#实质审查的生效;2021.07.16#公开

摘要：本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体为一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法。本发明从SELEX技术筛选所得核酸适配体的3D结构出发，通过自发结合模拟获得小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；并分析复合物的结构和关键结合位点，利用所得信息指导核酸适配体序列的截短优化。本发明已用于特异结合毒素TTX的核酸适配体TTX‑27的优化设计中；该核酸适配体通过SELEX技术筛选所得，亲和力为90.73nM。通过优化得到TTX‑27的一个截短型核酸适配体TTX‑D2，适配体序列截去13个碱基，采用MST实验验证该核酸适配体的亲和力提高了2倍；说明本优化方法是合理且有效的。

主权项：1.一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数；其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为靶标分子核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法LGA，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采用半柔性对接，即在对接过程中，核酸适配体的构象不发生变化，而靶标分子的构象在一定的范围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150Å；格点之间的间隔为0.375Å，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；其中，靶标小分子的AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模；在模拟体系中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15Å；为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后采用v-rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于150ns分子动力学模拟；第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；在第二步中获得了靶标分子与核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，根据轨迹中稳定结合状态下的复合物结构，分析结合模式，将远离结合部位的茎环序列截去，并利用mini-hairpin序列替代，获得截短优化适配体；Mini-hairpin的茎状结构含有3~4对互补的碱基对，环状结构含有3~4个孤立的碱基；Mini-hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA3Dstructuremodeling模块获得；第四步：利用分子对接评估优化方案；通过分子对接，预测靶标小分子与截短型核酸适配体结合时的解离平衡常数，并与第一步中预测的靶标分子与原核酸适配体结合时的解离平衡常数作比较，如果截短型核酸适配体解离平衡常数小于原核酸适配体解离平衡常数，表明优化设计初步成功；其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为截短型核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法LGA；对接方法采用半柔性对接；将对接格子的长宽高均设置为150Å；格点之间的间隔为0.375Å，对接格子的中心为截短型核酸适配体的几何中心；第五步：采用微量热泳动实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合强度；微量热泳动利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的相互作用；对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧光标记于核酸适配体3’端；核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，由此导致热泳动之后荧光信号值的变化；通过测量在不同结合程度下，样品溶液MST过程荧光变化信号，拟合得到关于该结合反应解离平衡常数Kd值。

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权利要求：

百度查询： 复旦大学 一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法

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