申请/专利权人：深圳市第三人民医院

申请日：2017-10-26

公开（公告）日：2021-08-27

公开（公告）号：CN107881195B

主分类号：C12N15/85(20060101)

分类号：C12N15/85(20060101);C12N5/10(20060101);A61K35/28(20150101);A61P1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.08.27#授权;2018.05.01#实质审查的生效;2018.04.06#公开

摘要：本发明公开了一种双基因共表达质粒pIRES2‑Nrf2‑DKK1。所述质粒包含原始表达载体pIRES2‑zsGreen，Nrf2和DKK‑1基因的CDS序列；所述质粒全长7151bp，其序列如SEQIDNO：1所示，其中Nrf2基因序列位于第619～2436位，DKK‑1基因序列位于第3016～3816位。所述双基因共表达质粒在人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞中可高效表达，并且能够显著增加间充质干细胞抗氧化、抗炎症、抗凋亡的能力；体内实验证明，移植经该质粒转染后的间充质干细胞能够显著改善小鼠的肝损伤现象，有助于提高间充质干细胞的移植治疗效果，具有较大的应用前景。

主权项：1.一种双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1，其特征在于，包含原始表达载体pIRES2-zsGreen，Nrf2和DKK-1基因的CDS序列；所述质粒全长7151bp，其序列如SEQIDNO：1所示，其中Nrf2基因序列位于第619～2436位，DKK-1基因序列位于第3016～3816位；所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1的制备方法为克隆Nrf2和DKK-1基因的CDS序列，以pIRES2-zsGreen载体为骨架，用DKK-1CDS序列替代pIRES2-zsGreen载体上的zsGreen基因，然后将Nrf2CDS序列克隆至pIRES2-DKK1载体的SacI和BamHI酶切位点之间。

全文数据：一种双基因共表达质粒P|RES2-Nrf2-DKK1及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1及其制备方法和应用。背景技术[0002]_近年来，酒精性和药物性原因引起的肝损伤患者所占比重在不断上升。流行病学数据显示，世界上肝病死亡的人口中约有3•8%是由饮酒引起的酒精性肝硬化所导致。同时，每年约10%的急性肝炎病例为药物性肝损伤。这些由酒精或药物引起的肝损伤患者均有可能进展为肝癌、肝硬化和肝衰竭，目前在临床上，医生主要使用具有保肝作用的药物对对症状较轻的肝损伤患者进行保守治疗，但重症患者仍只有通过肝移植术才有可能改善病情。虽然肝移植术是治疗终末端肝病的最有效方法，但器官的短缺、费用的昂贵加上手术并发症和免疫排斥等严重影响了患者的预后。因此，有必要寻找安全有效、又能被广大患者所接受的治疗方法。[0003]随着再生医学的快速发展，科学家发现干细胞移植为治疗肝病提供了广阔的应用前景。特别是基于间充质干细胞的替代疗法已经进入临床试验阶段。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，主要来源于脂肪、脐带、骨髓、牙髓、滑膜、羊水、肌肉、肝、胰腺等部位。其中脂肪和脐带组织来源的间充质干细胞因来源丰富、取材简便、增殖能力较强、免疫原性较低等优势，被认为是细胞移植治疗中的理想种子细胞。已有动物实验和临床研究表明脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞在肝组织损伤修复过程中能够起到治疗性作用。[0004]目前，多种疾病的干细胞治疗已进入临床治疗试验阶段，也取得了一定疗效。但总体来说移植效率低下，临床疗效不明显，这主要体现在移植后的细胞存活率低，移植的细胞不能很好地融入宿主组织中，或者在成功融入后又在短期内消失，甚至少量存活细胞的功能也受到了影响。大部分的研宄表明这主要归因于移植部位的氧化压力和炎症反应等恶劣环境，因此导致千细胞活性降低、发生凋亡的细胞数量上升，从而影响移植细胞对损伤部位的治疗效果。因此，寻找安全有效的策略用于提高干细胞的抗凋亡、抗氧化、抗炎症能力，对于提高干细胞的移植治疗效率具有重要意义。[0005]目前的研宄中，部分研宄人员发现通过添加抗氧化剂或自由基清除剂如N-乙酰半胱氨酸N-acetylcysteine，NAC和伊达拉奉Edaravone,Eda等可通过调节抗氧化酶的水平缓解炎症和氧化作用对体外培养中的细胞造成的压力环境。除此之外，人们己证明在细胞培养过程中，通过向培养基中添加一定浓度的生长因子如表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子等，或者添加一些小分子化合物调控细胞内的信号表达均可以加快细胞的增殖和移植后的存活能力。然而，这些生长因子或小分子成分的加入，一定程度上将影响移植治疗用细胞的表型和移植后的稳定性，且未能显著增加移植后的干细胞抗逆境生长环境的能力及移植治疗效果，较难直接应用于临床治疗。因此，寻找能够稳定高效的提高干细胞的抗氧化和抗炎症能力的方法是目前亟待解决的问题。发明内容[0006]本发明所要解决的技术问题是克服现有干细胞治疗过程中，干细胞活性降低、发生凋亡的细胞数量上升，从而影响移植细胞对损伤部位的治疗效果等缺陷和不足，提供一种可在干细胞中高效表达且可以显著增加间充质干细胞抗氧化、抗炎症、抗凋亡的能力的双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl。[0007]本发明的目的是提供一种双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1。[0008]本发明的另一目的是提供所述双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1的制备方法。[0009]本发明的再一目的是提供所述双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1的应用。[0010]本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本发明首先提供Nrf2和DKK-1基因在提高间充质干细胞抗应激能力中的应用，所述应用为同时过表达Nrf2和DKK-1基因。[0011]—种双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1，包含原始表达载体pIRES2-ZSGreen，Nrf2和DKK-1基因的CDS序列;所述质粒全长7151bp，其序列如SEQIDN0:1所示，其中Nrf2基因序列位于第619〜2436位，DKK-1基因序列位于第3016〜3816位。[0012]上述双基因共表达质SpIRES2-Nrf2-DKKl的制备方法，根据NCBI上Nrf2NM_0〇6164和DKK-1顺_〇12242的序列信息，克隆Nrf2和DKK-1基因的CDS序列，以pIRES2-zsGreen载体为骨架，先用DKK-1CDS序列替代pIRES2-zsGreen载体上的zsGreen基因，然后将Nrf2CDS序列克隆至PIRES2-DKK1载体的SacI和BamHI酶切位点之间;所述Nrf2和DKK-1基因的⑶S序列依次如SEQIDN0:2〜3所示。[0013]本发明采用Lipofectamine3000方法分别将上述构建好的双基因共表达质粒pIRES2_Nrf2-DKKl转染脂肪间充质干细胞（Humanadipose-derivedstemcells,hADMSCs和脐带间充质干细胞（Humanumbilicalcordmesenchymastemcells,hUCMSCs，并分别在转染后〇d，Id，2d，3d，4d，5d分别收集细胞检测Nrf2和DKK-1蛋白的表达，结果表明，Nrf2蛋白、总DKK-1和分泌型DKK-1蛋白在双基因共表达质粒转染hADMSCs和hUCMSCs第2天开始增加，在第3天时达到高峰，第5天恢复基础水平。表明双基因共表达质粒已被成功构建，并可稳定高效地表达在hADMSCs和hUCMSCs上。基于以上的发现，在后续的研究中，我们在转染后第3天给予间充质干细胞Mesenchymastemcells,MSCs添加细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS和过氧化氢（Hydrogenperoxidesolution,H2O2处理，以评估质粒转染对细胞可能的保护作用。[00M]LPS和H202联合作用已被证明能够诱导细胞凋亡、细胞坏死、炎症反应和氧化应激反应，本发明采用浓度0.1ygmL的LPS和200yM的H2O2共同刺激hADMSCs和hUCMSCs，结果表明:MSCs在受到外界刺激LPS+H2〇2时其生命活性明显受到威胁，其细胞活性显著下降。[0015]本发明选取传代培养至第三代，生长汇合度达60%左右的hADMSCs和hUCMSCs为研究对象。采用lipofectamine3000转染方法将双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl转入上述两种MSCs中，72小时后加入LPS和H2O2,随后继续培养24小时，最后收集细胞分别检测与细胞活性、细胞凋亡、细胞氧化水平相关指标的变化，以检测双基因共表达质粒对人MSCs抗氧化压力和抗炎症能力的影响。结果显示，在LPS和H2〇2联合作用的应激条件下，转染双基因共表达质粒组能够保持更好的细胞活性;与对照组相比，转染双基因共表达质粒组有较少比例的细胞呈现凋亡状态。采用体外DMPO绿色荧光染色法和MitoSOX染色法检测双基因共表达质粒对hADMSCs和hUCMSCs抵抗LPS及H2〇2造成氧化压力和炎症反应的作用，结果显示，转染双基因共表达质粒能够缓解这一现象，能够有效的降低hADMSCs和hUCMSCs细胞内和线粒体内的活性氧水平。[0016]因此，本发明所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl在提高间充质干细胞抗应激能力中的应用和或在制备提高间充质千细胞抗应激能力制剂或药物中的应用亦在本发明保护范围内。[0017]同时，本发明还提供一种提高间充质干细胞抗应激能力的制剂或药物，所述制剂或药物包含权利要求1所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl。[0018]具体地，所述应用是将双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1转染至间充质干细胞中进行表达。[0019]优选地，所述转染米用lipofectamine3000转染方法。[0020]优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞和或脐带间充质干细胞。[0021]具体地，所述抗应激能力为抗氧化、抗炎症和或抗凋亡能力。[0022]同时，本发明选取6〜8周龄N0DSCID小鼠为研宄对象，采用腹腔注射D-氨基半乳糖①-galactosamine，Gal和LPS的方法构建小鼠急性肝损伤模型；采用连续12天喂食5%的Lieber-DeCar1i酒精餐食，并在正常进食后饮用5gkg酒精的方法构建小鼠慢性酒精性肝损伤模型;采用尾静脉注射的方法将转染或未转染双基因共表达质粒的MSCs注入小鼠体内。最后，将小鼠麻醉处死后采集血液和肝脏组织，通过检测与肝功能、肝损伤、肝再生相关的指标分析双基因共表达质粒对MSCs移植治疗急性肝损伤和慢性酒精性肝损伤小鼠模型的有效性。结果显示，双基因共表达质粒的使用，能使hADMSCs和hUCMSCs移植后ALT、AST、MDA、TNF-a、Caspase-37等指标显著下降，并提高0SM基因的表达，能够显著改善小鼠的肝损伤现象，有助于提高间充质干细胞对肝损伤的移植治疗效果。[0023]因此，本发明所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1在干细胞移植临床治疗中的应用亦在本发明保护范围内。[0024]具体是在干细胞移植治疗急性肝损伤和慢性酒精性肝损伤中的应用和或在制备治疗急性肝损伤和慢性酒精性肝损伤药剂中的应用。[0025]本发明还提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞转染有上述双基因共表达质粒pIRES2_Nrf2-DKK1。[0026]同时，所述转染有上述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1的间充质千细胞在治疗肝损伤中的和或在制备治疗肝损伤制剂中的应用均在本发明保护范围内。[0027]具体地，所述应用是先将双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl转染间充质干细胞，再将转染后的间充质干细胞治疗移植受损肝细胞。[0028]优选地，所述肝损伤为急性肝损伤和或慢性酒精性肝损伤。[0029]另外，本发明还提供一种间充质千细胞制剂，所述制剂包含上述转染有上述双基因共表达质粒pIRES2_Nrf2_DKK1的间充质干细胞;在治疗急性肝损伤和或慢性酒精性肝损伤时，通过将所述间充质干细胞制剂移植到肝损伤组织中进行治疗。[0030]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明针对现有干细胞移植治疗存在干细胞活性降低、临床疗效不明显等缺陷和不足，提供了一种提高间充质干细胞抗应激能力的双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl;体外细胞培养实验及小鼠体内试验表明，Nrf2和DKK-1基因的同时过表达能够提高干细胞抵抗逆境生长压力的能力，同时能够保证间充质干细胞MSCs的持续增殖，并维持MSCs的表型和功能的稳定。本发明在MSCs体外培养的增殖效率、表型稳定性及安全性方面达到了现有培养体系水平，同时由于极大提高了移植后治疗急性肝损伤和慢性酒精性肝损伤的效率，使所培养的MSCs更适用于在多种疾病的干细胞移植临床治疗中使用。附图说明[0031]图1为本发明双基因共表达载体pIRES2-Nrf2-DKK1的结构示意图。[0032]图2为本发明转染双基因共表达质粒不同天数后Nrf2和DKK-1的表达情况，其中左边和右边分别为hADMSCs和hUCMSCs转染双基因共表达质粒后Nrf2蛋白和DKK-1蛋白的表达情况。[0033]图3为本发明双基因共表达质粒对hADMSCs和hUCMSCs抵抗LPS及H2〇2造成细胞损伤的作用。可见在应激条件下，转染双基因共表达质粒组能够保持更好的细胞活性。[0034]图4为本发明双基因共表达质粒对hADMSCs和hUCMSCs抵抗LPS及H2〇2造成细胞凋亡的作用。可见在应激条件下，转染双基因共表达质粒组有较少比例的细胞呈现凋亡状态。[0035]图5为本发明双基因共表达质粒对hADMSCs和hUCMSCs抵抗LPS及H2O2造成氧化压力和炎症反应的作用。其中A为DMPO染色的结果，可见使用LPS及H2O2刺激后，转染双基因共表达质粒组可降低DMPO对细胞的染色;B为MitoSOX染色检测hUCMSCs中线粒体的活性氧水平，与未转染组比较，转染双基因共表达质粒组增加了hUCMSCs线粒体内的活性氧水平。[0036]图6为本发明双基因共表达质粒对小鼠急性肝损伤hADMSCs移植治疗的作用。其中A图为小鼠HE染色结果;B图为Livernecrosis评价结果，显示转染双基因共表达质粒的hADMSCs移植小鼠肝纤维化程度显著降低;C图为人类唐氏综合症基因检测结果，显示转染双基因共表达质粒的hADMSCs在受体小鼠体内归巢能力较强;D-I为各项肝功能评价指标，双基因共表达质粒的使用，能使hADMSCs移植后ALT、AST、MDA、TNF-a、Caspase-37等指标显著下降，并提高0SM基因的表达。[0037]图7为本发明双基因共表达质粒对小鼠急性肝损伤hUCMSCs移植治疗的作用。其中A图为小鼠HE染色结果;B图为Livernecrosis评价结果，显示转染双基因共表达质粒的hUCMSCs移植小鼠肝纤维化程度显著降低;C图为人类唐氏综合症基因检测结果，显示转染双基因共表达质粒的hUCMSCs在受体小鼠体内归巢能力较强;D-I为各项肝功能评价指标，双基因共表达质粒质粒的使用，能使hUCMSCs移植后标显著下降，并提高0SM基因的表达。[0038]图8为本发明双基因共表达质粒对小鼠慢性酒精性肝损伤hADMSCs移植治疗的作用。其中A图为小鼠HE染色和天狼星红染色结果;B图为NAFLDactivityscore评价结果，显示转染双基因共表达质粒的hADMSCs移植小鼠肝纤维化程度显著降低;C图为人类唐氏综合症基因检测结果，显示转染双基因共表达质粒的hADMSCs在受体小鼠体内归巢能力较强;D_J为各项肝功能评价指标，双基因共表达质粒的使用，能使hADMSCs移植后ALT、AST、MDA、1阶-、〇8口330-37、31^8?-13等指标显著下降，并提高^1基因的表达。[0039]图9为本发明双基因共表达质粒对小鼠慢性酒精性肝损伤huCMSCs移植治疗的作，。其中A图为小鼠HE染色和天狼星红染色结果;B图为NAFLDactivity从〇1_6评价结果，显示转染双基因共表达质粒的hUCMSCs移植小鼠肝纤维化程度显著降低;c图为人类唐氏综合症基因检测结果，显示转染双基因共表达质粒的hUCMSCs在受体小鼠体内归巢能力较强;D_J为各项肝功能评价指标，双基因共表达质粒的使用，能使hUCMSCs移植后ALT、AST、MDA、TNF-a、Caspase-37、SREBP-lc等指标显著下降，并提高〇SM基因的表达。具体实施方式[0040]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。[0041]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。[0042]本发明中，细胞凋亡apoptosis是指干细胞在发育过程中为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。现有技术中，细胞凋亡情况通常根据凋亡细胞占总细胞的百分比来判断，对凋亡细胞的检测方法有形态观察法、HoechesPI双染法、AnnexinV流式细胞仪检测法、线粒体膜势能的检测、TUNEL法等，本发明对细胞凋亡的检测采用HoechesPI双染法。[0043]细胞存活率cellviability是指存活细胞数占总细胞数的百分率。现有的检测方法主要有MTT法或台酚蓝染色计数法。本发明对细胞存活率的检测采用MTT法。[0044]氧化应激是指机体在各种有害环境压力或化学物质的刺激下，活性氧生成与清除失衡，倾向于氧化，从而造成的毒害作用。由高氧条件、外源性活性氧引起的氧化应激是诱导细胞衰老的重要因素，也是诱导疾病或癌症发生的一个重要机制。活性氧由〇2-、〇H等极性分子以及H2〇2等非极性分子构成，其中H2〇2是形成氧化应激的主要活性氧类和相关研宄中造成氧化应激环境的诱导剂。本发明对R0S水平的检测采用体外DMP0绿色荧光染色法和MitoSOX染色法进行。[0045]干细胞移植治疗是指把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。[0046]GalLPS为D-氨基半乳糖D-Gal脂多糖LPS处理。[0047]急性肝损伤是指患者在无慢性肝病的基础上，由于各种病因导致肝脏细胞损伤而发生。本发明采用的急性肝损伤小鼠为N0DSCID小鼠，由GalLPS同时腹腔注射小鼠诱导形成急性肝损伤模型。[0048]慢性酒精性肝损伤是指患者在无慢性肝病的基础上，由于不适当饮酒导致肝脏细胞损伤而发生。本发明采用的慢性酒精性肝损伤小鼠为N0DSCID小鼠，由连续15天喂食5%的Lieber-DeCarli酒精餐食，并在正常进食后饮用5gkg酒精诱导形成慢性酒精性肝损伤模型。[0049]本发明主要采用苏木精-伊红HE染色法和天狼染色法对肝脏组织进行染色，HE染色可清晰显示出组织结构和细胞形态，天狼星红主要对肝脏中纤维化的组织进行染色。天狼星红染色越多，说明肝纤维化程度越严重。[0050]本发明中Livernecrosis主要用于定量肝脏坏死的程度，NAFLDactivityscore是用于定M脂肪性肝病的~个指标，包括肝内脂滴、炎症和纤维化水平。[0051]本发明中人源基因与宿主基因组之间的比率用于衡量将干细胞制剂移植入小鼠体内后，移植的人源干细胞在小鼠体内的存活情况，即衡量干细胞移植效率。本发明中用于鉴定人源干细胞或小鼠体细胞的基因是人类唐氏综合症基因。本发明人根据序列差异，设计引物并采用实时定量PCR法进行测定。[0052]ALT谷丙转氨酶）、AST谷草转氨酶主要存在于肝细胞中，是衡量肝功能的重要指标。当肝脏发生损伤时，ALT和AST的表达量将会发生改变。临床上，ALT和AST的水平常用来提示肝脏功能正常与否。常见的，急性肝损伤和慢性酒精性肝损伤小鼠的AST和ALT的表达量将会升高。[0053]MDA是最常用的衡量肝脏内氧化应激压力的标志物。0SM属IL-6家族细胞因子家族，对于肝脏再生有重要作用。0SM水平的提高提示移植细胞促进了小鼠自身肝脏的再生。SREBP-lc蛋白表达水平越高，说明脂肪合成代谢越活跃，与脂肪肝呈正相关关系。[0054]肿瘤坏死因子aTNFa被证明与细胞凋亡相关，其表达量越高，表示肝损伤程度越深。caspase是一类存在于细胞质中具有类似结构的半胱氨酸蛋白水解酶，其中，caspase37表示caspase3和caspase7,其能够导致细胞直接调亡。[0055]实施例1双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl的构建1、根据NCBI上Nrf2NM_0〇6164和DKK-1NM_012242的序列信息，克隆Nrf2和DKK-1基因的CDS序列，所述Nrf2和DKK-1基因的CDS序列序列如SEQIDN0:1〜2所示；以pIRES2-zsGreen载体为骨架，用DKK-1CDS序列替代pIRES2-ZSGreen载体上的EGFP基因，然后将Nrf2CDS序列克隆至pIRES2-DKKl载体的SacI和BamHI酶切位点之间；2、结果所述双基因共表达质粒全长715lbp，其中Nrf2基因序列位于第619〜2436位，DKK-1基因序列位于第3016〜3816位。[0056]实施例2当第三代脂肪间充质千细胞购自广州赛业公司）和脐带间充质干细胞脐带组织来源于深圳市第三人民医院妇产科健康产妇剖宫产胎儿）生长汇合度达到60%左右时，采用Lipofectamine3000转染的方法将双基因共表达质粒转入上述两种细胞中，转染程序参照商家说明书进行，转染结束后，于37°C培养箱中继续孵育72小时；随后，加入0.1ugmL的LPS和浓度为200uM的H2〇2共同刺激24小时，以未经外界刺激LPS+H2O2和未转染双基因共表达质粒的细胞为阴性对照。最后，收集各组细胞检测与细胞活性、细胞凋亡、细胞氧化相关的指标水平。[0057]细胞活性检测采用MTT法，即hADMSCs和hUCMSCsn=4接受完相关处理后加入5mgmLMTT孵育3小时。然后移除细胞培养基，加入适量DMS0溶解MTT，于570nm酶标仪上定量测定细胞活性的变化。研宄发现hADMSCs和hUCMSCs在受到外界刺激LPS+H2〇2时其生命活性明显受到威胁，其细胞活性显著下降；而转染双基因共表达质粒，可显著提高细胞活性图3。[0058]细胞凋亡检测采用HoechesPI双染法进行，S卩hADMSCs和hUCMSCsn=4接受完相关处理后，同时加入5UgtnLDAPI和5ugmL碘化丙啶PI，避光孵育15分钟，然后于荧光显微镜下观察计数。细胞应分为3种形态:健康细胞只有较淡的蓝色荧光、凋亡细胞是较深的蓝色荧光，凋亡后期和坏死细胞为较深的红色荧光。研宄发现hADMSCs和hUCMSCs在受到外界刺激LPS+H2〇2时发生凋亡的效率明显提高;而转染双基因共表达质粒，可降低细胞凋亡的发生图4。[0059]细胞内氧化水平采用DMPO绿色荧光染色法对R〇S信号进行检测。DMPO是一种自由基染料，能够显示细胞中自由基的分布。绿色是DMPO的染色，蓝色是细胞核。当hADMSCs和hUCMSCs接受完相关处理后，将细胞取出，吸千细胞孔板内的培养基，经PBS洗一遍后，相继进行固定、透化、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染核、拍照等实验操作，最后进行统计学分析。[0060]细胞线粒体内的活性氧水平采用MitoS〇x染色法进行检测。实验的分组情况为：Unstained，不作任何处理的正常间充质千细胞;Ctrl，不作处理进行DMPO染色的正常间充质干细胞;LPS+H2O2，以LPS和H2O2共同刺激后进行DMPO染色的间充质干细胞;Plasmid，不以LPS和賊2刺激间充质干细胞，转染双基因共表达质粒后进行DMP0染色;LPS+H2〇2+Plasmid，转染双基因共表达质粒后，以LPS和H2〇2刺激间充质干细胞并进行DMPO染色。当hADMSCs和hUCMSCs接受完相关处理后，取出，用PBS洗1遍，用胰酶消化细胞，将细胞收集于流式管中，1000rpmX5min离心;随后，弃去上清，用PBS再洗一遍;接着，准备MitoSOX探针工作液，用含有钙镁成分的HBSS将MitoSOX稀释至5UM，每个样品管加入lmL工作液，混匀，置于37°C避光孵育lOmin;随后进行离心，并以非冷却HBSS缓冲液温和洗涤细胞3次，lOOOrpmX5min离心;最后，弃上清，加入500uLPBS重悬细胞，利用筛网过滤细胞，上机过流式。[0061]结果表明，LPSH2〇2明显上调R0S信号表达，而转染双基因共表达质粒能够缓解这一现象，能够有效的降低细胞内和线粒体内的活性氧水平（图5,其中左边是DMPO染色的定量数据，右边是MitoSOX染色的流式结果）。[0062]实施例3采用腹腔注射法同时注射Gal及LPS的PBS溶液构建小鼠急性肝损伤模型。实验使用N0DSCID雄性小鼠，在同时注射Gal+LPS6小时后采用尾静脉注射法注射2xl06预先转染的hADMSCs和hUCMSCs进行移植治疗。3日后收集小鼠血清及肝脏组织进行后续实验。[0063]分组情况为:Gal+LPS表示同时用Gal和LPS共同腹腔注射小鼠。[0064]Healthy为不作任何处理的健康小鼠。[0065]Gal+LPS+Nostemcell表示先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后，不注射干细胞的小鼠；Gal+LPS+Stemcell表示先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后，尾静脉注射不经处理的hADMSCs和hUCMSCs;Gal+LPS+Stemcell+Plasmid表示先向小鼠体内腹腔注射Gal和LPS后，尾静脉注射经双基因共表达质粒转染处理的hADMSCs和hUCMSCs;Gal的注射量为600mgkg;LPS的注射量为8ugkg;干细胞的注射量为2X1〇6个（以生理盐水悬浮）；Gal和LPS均购自于美国Sigma-Aldrich公司。[0066]实施例4采用连续12天喂食5%的Lieber-DeCarli酒精餐食，并在正常进食后饮用5gkg酒精的方法构建小鼠慢性酒精性肝损伤模型。实验使用N0DSCID雄性小鼠。实验小鼠发生酒精性肝损伤后3日及9日采用尾静脉注射法分别注射2xl06预先转染的hADMSCs和hUCMSCs进行移植治疗。在小鼠最后一次饮用酒精9小时后收集小鼠血清及肝脏组织进行后续实验。[0067]NIAAA表示用酒精灌胃小鼠。[0068]Healthy为不作任何处理的健康小鼠。[0069]NIAAA+Nostemcell表示向小鼠体内灌冑酒精后，不注射干细胞的小鼠；NIAAA+Stemcel1表示先向小鼠体内灌冑酒精后，尾静脉注射不经处理的hADMSCs和hUCMSCs；NIAAA+Stemcell+Plasmid表示先向小鼠体内灌胃酒精后，尾静脉注射经双基因共表达质粒转染处理的hADMSCs和hUCMSCs;实施例5小鼠在麻醉处死后迅速收集肝脏样本用福尔马林固定，进行石蜡切片工作，最后进行HE染色;另外，对急性肝损伤模型小鼠肝组织进行Livernecrosis检测，对慢性非酒精性肝损伤模型小鼠肝组织进行天狼星红染色和NAFLDactivityscore检测，从而观察肝脏组织学的变化。[0070]结果发现，注射Gal+LPS后能够明显增强组织细胞发生炎性及坏死的情况，之后注射MSCs能够缓解损伤，且注射经双基因共表达质粒转染后的MSCs能更好地缓解这一现象图6AB、图7AB、图8AB、图9AB。[0071]实施例6时定量PCR测定人源基因与宿主基因组之间的比率，以定量移植入小鼠肝脏中的人源细胞量。结果发现只注射MSCs可使宿主体内人源细胞有所增加;但在注射Gal+LPS后再注射经双基因共表达质粒转染后的MSCs，能够更显著地增加宿主体内的人源细胞，说明双基因共表达质粒能够加强MSCs的移植治疗效果图6C、图7C、图8C、图90。[0072]实施例6小鼠在麻醉处死后迅速采集血样，然后于4度1000xg离心10分钟获得血清，采用SGPT和SGPT试剂盒测定血清中ALT和AST的浓度变化。[0073]结果表明：注射MSCs能显著降低小鼠体内AST和ALT水平，而在注射Gal+LPS后再注射经双基因共表达质粒转染后的MSCs，能够进一步降低小鼠血清中的AST和ALT水平（图6DE、图7DE、图8DE、图9DE;实施例7实时定量PCR测定小鼠肝脏内的MDA图6F、图7F、图8F、图9F、OSMmRNA图61、图71、图81、图9I、SREBP-lc图8J、图9J的表达水平。结果发现，注射MSCs能显著降低小鼠体内MDA和SREBP-lc水平，提高OSMmRNA的水平，而在注射Gal+LPS后再注射经双基因共表达质粒转染后的间MSCs，能够进一步降低小鼠血液中的MDA和SREBP-lc水平，同时进一步提高0SMmRNA水平。[0074]实施例8采用ELISA酶联免疫技术检测小鼠肝脏中的TNF-a的量（图6G、图7G、图8G、图9G和caspase37活性水平（图6H、图7H、图8H、图9H;结果表明：注射MSCs能显著降低小鼠体内TNF-a和caspase37水平，显示小鼠肝脏发生凋亡的细胞量有所减少;而在注射Gal+LPS后再注射经双基因共表达质粒转染后的MSCs，能够进一步降低小鼠体内TNF-a和caSpaSe37水平，说明双基因共表达质粒能够促进供体MSCs的增殖，并抑制其凋亡。[0075]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：l_Nrf2和DKK-1基因在提高间充质干细胞抗应激能力中的应用，其特征在于，同时过表达Nrf2和DKK-1基因。2.—种双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl，其特征在于，包含原始表达载体pIRES2-zsGreen，Nrf2和DKK-1基因的CDS序列；所述质粒全长7151bp，其序列如SEQIDNO:1所示，其中Nrf2基因序列位于第619〜2436位，DKK-1基因序列位于第3016〜3816位。3.权利要求1所述双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1的制备方法，其特征在于，克隆Nrf2和DKK-1基因的CDS序列，以pIRES2_zsGreen载体为骨架，用DKK-1CDS序列替代pIRES2-zsGreen载体上的zsGreen基因，然后将Nrf2CDS序列克隆至pIRES2-DKKl载体的SacI和BamHI酶切位点之间。4.权利要求1所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl在提高间充质干细胞抗应激能力中的应用。5.权利要求1所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKK1在制备提高间充质干细胞抗应激能力制剂中的应用。6.—种提高间充质干细胞抗应激能力的制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是将双基因共表达质粒PIRES2-Nrf2-DKK1转染至间充质干细胞中进行表达。8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞和或脐带间充质干细胞。9.一种间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞转染有权利要求1所述双基因共表达质粒pIRES2_Nrf2_DKK1。10.权利要求1所述双基因共表达质粒pIRES2-Nrf2-DKKl在干细胞移植临床治疗中的应用。

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