申请/专利权人：通用生物(安徽)股份有限公司

申请日：2023-12-01

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821516A

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N15/113;C12N5/10

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明提供了一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域，构建方法如下：Nrf2基因的CDS序列查找及靶点设计；shRNA分别合成及慢病毒载体构建；shRNA慢病毒包装及感染hepG2细胞；药物筛选及干扰稳定细胞株的的构建；qPCR检测检测Nrf2基因的干扰效率；通过Nrf2基因靶点干扰靶点设计，shRNA序列合成，载体构建及抽提，慢病毒包装，慢病毒感染hepG2细胞株，药物筛选稳定细胞株构建及检测等步骤制得一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株，此构建好的细胞株中,Nrf2基因的表达量相对于未做任何处理的野生型hepG2细胞株表达量明显下调。

主权项：1.一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：在NCBI上查到Nrf2基因的CDS区域的序列，如SEQIDNO.1所示，在所述Nrf2基因的CDS区域上设计三个感染靶点；步骤S2：将S1设计的三靶点，分别添加上载体上的酶切位点和loop环结构，分别合成六个引物；将六个引物分别两两配对进行退火反应，之后4℃储存备用；将抽提好的感染慢病毒空载使用BamHI和EcoRI线性化之后胶回收用于后续的连接反应，配制好连接反应体系后，室温离心，于PCR仪上25℃恒温连接15分钟，连接完成之后，进行感受态转化，最终挑取单克隆进行扩增，然后进行质粒抽提之后测序，得到测序验证正确的克隆扩大进行质粒大抽，最终得到测序验证正确的大抽慢病毒质粒：步骤S3：将上述测序验证正确的大抽慢病毒质粒分别进行慢病毒包装，之后进行滴度测定，最终得到慢病毒，将得到的慢病毒分别以MOI为20感染hepG2细胞株；步骤S4：在上述慢病毒感染的hepG2细胞株在感染72h时，使用1ugml的嘌呤霉素进行药物筛选，筛选72h后，对存活下来的细胞进行扩大培养，分别得到构建好的hepG2干扰细胞株；步骤S5：将上述构建好的hepG2干扰细胞株和野生型hepG2细胞株使用trizol方法进行RNA提取，反转录成CDNA之后进行qPCR检测靶点的干扰效率即可。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 通用生物(安徽)股份有限公司 一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD